Messung der Elektrophorese-Mobilität von Proteinen – Zetasizer Nano ZSP

Messung der Elektrophorese-Mobilität von Proteinen mit dem Zetasizer Nano ZSP 

Einleitung  

   Zetasizer Nano ist ein führendes Produkt auf dem Markt der dynamischen Lichtstreuung und Elektrophorese-Lichtstreuung für die Messung von hydrodynamischer Größe und Elektrophorese-Mobilität.  

   Die dynamische Lichtstreuung (DLS) ist eine weitverbreitete Methode zur Charakterisierung von Proteinen und deren Präparationen, mit der es möglich ist, nicht nur die Größe der Moleküle zu messen, sondern auch die Stabilität zu bewerten.  

   In jüngster Zeit gewinnt die Stabilität von Proteinen in Lösungen sowohl wissenschaftlich als auch kommerziell an Interesse, da der Einsatz von Proteinen als biologische Therapeutika rapide zunimmt. Ein umfassendes Verständnis der Stabilität und des Verhaltens von Präparationen ist von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung sicherer und vermarktbarer Produkte, was die Nachfrage nach Werkzeugen für die Analyse dieser Eigenschaften erhöht. 

   Die mit Elektrophorese-Lichtstreuung (ELS) gemessene Mobilität der Proteine kann als Indikator für das Verhalten, die Viskositätsstabilität von Präparationen dienen[1].
 

   Die experimentelle Messung der Proteinmobilität stellt zwei wesentliche Herausforderungen dar.  

(i) Der Umgang mit Proteinlösungen bedeutet meist den Umgang mit verdünnten Konzentrationen. Der Begriff DLS beinhaltet, dass es sich auch um niedrigen Streulichtpegel proportional zu kleinen Molekülgrößen handelt. Bisher auf den Markt gebrachten Geräte, die auf Lichtstreuung basieren, hatten nicht die erforderliche Empfindlichkeit für solche Messungen.  

(ii) Zur Messung der Mobilität von Proteinen muss ein elektrisches Feld auf die Probe angelegt werden, was zur Aggregation führt und die Proteine physikalisch schädigen kann[2]. Folglich spiegeln die Messergebnisse eher die Aggregation der Moleküle wider als die ursprünglich messbaren Probenproteine. 

Drei Anforderungen sind erforderlich, um die Mobilität von Proteinen genau und präzise zu messen.
1. Ein Gerät mit ausreichender Empfindlichkeit, um niedrige Elektrophorese-Mobilität und niedrige Zählraten in Bezug auf Proteinverdünnungslösungen zu erfassen
2. Messtechniken zur Verringerung des Aggregationsrisikos
3. Intelligente, automatisierte Messverfahren zur Erkennung und Minimierung von Aggregationen  

   Der Zetasizer Nano ZSP (ZSP, Abbildung 1A) und die zugehörige Software wurden speziell entwickelt, um diese Anforderungen zu erfüllen. Bei der Messung der Mobilität von Proben mit einer niedrigen Konzentration wie Lysozym (ca. 1mg/ml) ermöglicht die Lichtstreu-Empfindlichkeit des Geräts die Analyse von kleinen Partikeln und niedrigen Konzentrationen. Darüber hinaus verbessert die in der ZSP eingesetzte Phaseninterferenzlichtstreutechnik (PALS) die Messleistung bei Proben mit niedriger Mobilität wie Proteine.  

   Die Wissenschaftler von Malvern Instruments haben enthüllt, dass ein erheblicher Teil der Aggregationen während der Elektrophoresemessungen an den Elektroden auftritt[3]. Mit der von Malvern Instruments erfundenen und patentierten Anti-Diffusionsmethode (Abbildung 1B) können Proteine von den Elektroden der Zelle getrennt und geschützt werden[2, 4].  

   Das bedeutet, dass Spannung über längere Zeiträume angelegt werden kann, um verlässlichere Daten zu erhalten[3]. Die Diffusionsbarrierenmethode wurde unter Bezugnahme auf den neuesten ASTM-Standard zur Messung der Mobilität von nanoskaligen biochemischen Stoffen entwickelt[2]. 

   Die Zetasizer-Software enthält außerdem ein dediziertes Protokoll für die Messung der Proteinmobilität. Diese Messtechnik reduziert die Spannung auf ein Maß, das Aggregationen verhindert und kontrolliert sorgfältig die Temperatur innerhalb der Zelle, um Aggregationen der Probe zu vermeiden.  

   Vor und nach der Mobilitätsmessung misst das System auch die Größe mit derselben optischen Ausrüstung (Abbildung 2). Daher repräsentiert die gemessene Größenverteilung direkt die Population, der die Mobilität gemessen wurde. Wenn verschiedene optische Geräte zur Messung der Partikelgröße verwendet werden, könnte sich die Streulichtintensität ändern und es könnte möglicherweise Cluster verschleiern. Durch Verwendung derselben optischen Ausrüstung zur Größenmessung vor und nach der Messung der Mobilität identifiziert der Zetasizer Nano ZSP potentiell auftretende zufällige Aggregationen während des Messprozesses. 

   Schließlich kann die genaue Messung der elektrophoretischen Mobilität von Proteinen dazu genutzt werden, um die Ladung von Proteinen basierend auf der bereits bekannten Beziehung zwischen Proteinmobilität und -ladung zu berechnen[5].  

   Mit der neuen Rechner-Option in der Zetasizer-Software kann dies berechnet werden. Diese Anwendungshinweise beschreiben die Messung der Proteinmobilität mit dem ZSP. Mit der Empfindlichkeit des ZSP, der effektiven Implementierung der Diffusionsbarrierenmethode und dem geeigneten Messprotokoll können die präzisesten möglichen Messwerte erzielt werden.
 

Methode
 

   Humanes Serumalbumin (HSA) wurde unter Verwendung zweier Arten von Puffern jeweils auf eine Endkonzentration von etwa 2mg/ml vorbereitet. Die Bedingungen der verwendeten Puffer sind wie folgt. 

 1) Puffer, in dem das Originalprotein bei pH 7 gelöst ist, 2) Citrate-Puffer mit pH 4.3. Um den Einfluss von Aggregaten vor Beginn der Messungen auszuschließen, wird die Probe durch einen 0,02μm Filter filtriert.  

   Mithilfe der Diffusionsbarrierenmethode kann verhindert werden, dass die Probe bei Kontakt mit den Elektroden aggregiert. Einwegfaltkapillarellen (disposable folded capillary cells) werden mit einer angemessenen Menge Puffer befüllt. Mithilfe einer Gelladepipette (gel loading pipette) wird ans Ende, wo das Licht passiert, 20μl HSA (2mg/ml) geladen. Nach dem Einsetzen der Zelle in das Gerät werden die Größe und das Zetapotential gemessen. 

   Die hydrodynamische Größe und Mobilität des HSA wird jeweils unter Verwendung des Zetasizer Nano ZSP durch DLS und ELS gemessen. Sowohl die Größe als auch die Mobilität werden bei demselben Streuwinkel gemessen, um sicherzustellen, dass das gemessene Zetapotential dem von Proteinen und nicht von aggregierten Materialien entspricht. 

Ergebnisse 

   Abbildung 3A und 3D zeigen die Größenverteilung der zu Beginn der Experimente bei pH 7 bzw. pH 4.3 gemessenen Proben auf. Wie erwartet ist zu erkennen, dass nur ein Peak in der Größenverteilung existiert. Die Größe bei pH 7 beträgt 3,8nm, was mit den für HSA berichteten Größen übereinstimmt.  

   Interessanterweise beträgt die Größe bei pH 4.3 4,1nm und ist somit etwas größer als bei pH 7. Es kann nicht festgestellt werden, ob dies auf eine strukturelle Veränderung, eine höhere Stufe der Oligomerisierung oder auf eine beginnende Aggregation hinweist. 

   Danach wird die Mobilitätsmessung der Probe begonnen und die Ergebnisse berechnet. Abbildung 3B und 3E zeigen Frequenzdiagramme der Mobilitätsmessung. Die Untersuchung der Frequenzdiagramme ist eine gute Methode zur Bewertung der Messqualität[6].  

   Proteine diffusieren sehr schnell, da sie klein sind. Während des Elektrophorese-Messverfahrens befinden sich Proteine im elektrophoretischen Zustand, jedoch kann die Diffusionsgeschwindigkeit nicht völlig durch die Elektrophorese überwunden werden.  

   Infolgedessen weist die Frequenzverschiebung des gestreuten Lichts aufgrund ihrer erheblichen diffusen Komponente breite Peaks auf. Frequenzdiagramme von Proben mit Aggregaten haben kleinere diffuse Komponenten und somit schmalere und spitzere Peaks, da Aggregate größer sind. Diese Thematik wird in Anwendungshinweis MRK1651-02 und Referenz[4] detaillierter erklärt. Hier zeigt das Frequenzdiagramm breite und flache Peaks, was bedeutet, dass die Messung hauptsächlich an Proteinen und nicht an Aggregaten durchgeführt wurde.
 

   Die bei HSA gemessene elektrophoretische Mobilität beträgt bei pH 7 -0,88±0,2μmcm/Vs und bei pH 4.3 0,44±0,2μmcm/Vs. Diese Ergebnisse zeigen, dass der isoelektrische Punkt der Probe zwischen diesen beiden pH-Werten liegt. 

   Nach der Messung der elektrophoretischen Mobilität kann die gesamte Ladung des Proteins unter Verwendung der neuen Option in der Zetasizer-Software berechnet werden. Laut Bild 4 beträgt die bei pH 7 berechnete HSA-Ladung etwa -18, während die bei pH 4,3 berechnete etwa +10 beträgt. 

   Abbildung 3C und 3F zeigen die Größenverteilung der Probe nach der Mobilitätsmessung. Die Ergebnisse zeigen, dass während des Messprozesses sehr geringe Mengen aggregiert wurden.  In beiden Fällen ist der Hauptpeak der Verteilung bei pH 7 für 99% des gestreuten Lichts dominant, während er bei pH 4.3 90% der Probe darstellt.

   Daher können die aus diesen Mobilitäten abgeleiteten Ergebnisse als zuverlässig angesehen werden. Interessanterweise zeigten die pH 4.3 Proben Tendenzen zur Aggregation, wenn sie eine Zeitlang ohne elektrisches Feld blieben, was wahrscheinlich mit dem niedrigen pH-Wert zusammenhängt. Diese Effekte könnten auch die minimalen Aggregationen erklären, die während des Messvorgangs aufgetreten sind.

Diskussion 

   Die insgesamt erzielten Ergebnisse bieten vergleichbare Mobilitätsmessungen, die gut mit bereits bekannten Werten übereinstimmen. Außerdem war die gemessene Mobilität umso deutlicher bei niedrigeren pH-Werten, was eine hohe Zuverlässigkeit der Genauigkeit der Ergebnisse erlaubt. Die wiederholte Messung und ihre Hervorragendheit war durch die großen, breiten Frequenzdiagramme und das minimale Niveau von Aggregation in den nachfolgenden DLS-Messungen nachvollziehbar.
 

   Die berechnete Proteine-Ladung wurde mit den von Tanford durchgeführten Untersuchungen verglichen[2]. Tanford zeigte, dass HSA bei pH 7 eine ungefähre Energie von -16 trägt, was eine gute Übereinstimmung mit den hier präsentierten Messungen anzeigt. Bei pH 4.3 wurde gezeigt, dass es etwa +20 trägt.  

   Dies ist noch überzeugender als die hier bereitgestellten Daten. Es gibt verschiedene mögliche Gründe, einschließlich der Puffersysteme, die in den Experimenten verwendet wurden, und der Quelle des HSA, jedoch sind die allgemeinen Werte in der Referenz [6] eindeutig dargelegt. 

   Durch die Kombination von Zetasizer Nano ZSP, Software und Anti-Drift-Methode wird sichergestellt, dass zuverlässige und präzise Messungen aus tatsächlichen Experimentierabläufen durchgeführt werden. Dies wird durch drei verschiedene Ansätze erreicht. 

   1. Die Anti-Diffusionsmethode verhindert, dass Proteine an der Elektrode aggregieren.
   2. Die Zetasizer-Software hat alle Optimierungen und Messungen der Proteingröße und des Zetapotentials automatisiert, um Benutzereingaben zu reduzieren und die Genauigkeit der Messungen zu verbessern.
   3. Mit dem Zetasizer Nano ZSP kann die Messung von Größe und Zetapotential mit demselben optischen Gerät durchgeführt werden, das eine hervorragende Empfindlichkeit bietet, und somit die Messgenauigkeit für den Benutzer gewährleistet. 

   Zusammenfassend wurde die Mobilität von HSA bei pH7 und pH4.3 in einem Puffer mit einer Konzentration von 2mg/ml erfolgreich gemessen. Die Diffusionsbarrierenmethode erfordert nur eine geringe Menge an Proteinen, was mit minimalen Probenkosten (in diesem Fall 20μl) zu solchen Messungen führt. 

[1] Laue, Proteins in Serum – Colloids vs molecular views, presentation at Colorado Protein Stability Conference, 2011
[2] ASTM2865 – Standard guide for measurement of electrophoretic mobility and zeta potential of nanosized biological materials
[3] Corbett, Connah & Mattison, Electrophoresis. In press 2011
[4] Corbett, Connah & Mattison, Patent Pending
[5] Loeb, A.L, Wiersema, P.H. and Overbeek, (1961) „The Electrical Double Layer around a Spherical Colloid Particle“ MIT Press, Cambridge Mass
[6] Corbett & Jack, Colloids & Surfaces A: Physiochemical and Engineering Aspects. (2010) 376 pp31-41