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Bestimmung des Proteinmolekulargewichts: 

SEC-MALS vs. konventionelle Kalibrierung

Die physikalischen Eigenschaften und das Verhalten von Proteinen in Lösung variieren abhängig von mehreren Faktoren, die mit der Reinheit und Formulierung des Proteins zusammenhängen, sowie von ihren eigenen einzigartigen Eigenschaften.

Größenausschlusschromatographie (SEC) ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das allgemein verwendet wird, um Faktoren wie die Wiederherstellung, das Molekulargewicht und die Aggregation von Proteinen zu untersuchen. 

Das Prinzip von SEC bezieht sich auf die Trennung von Proben durch einen durchlässigen und inerten Säulenmatrix. Kleine Moleküle durchqueren die Poren tiefer, während größere Moleküle ausgeschlossen werden und die Säule schneller passieren.  Das Ergebnis ist eine trennende Grundlage auf hydrodynamischem Volumen, aber das endgültige Ziel ist in der Regel, das Molekulargewicht zu bestätigen.

 Früher wurde das Molekulargewicht geschätzt, indem die Auslauzeit eines unbekannten Proteins mit einem standardisierten kugelförmigen Protein mit bekanntem Molekulargewicht verglichen wurde, eine Methode, die „konventionelle Kalibrierung“ genannt wird. Diese Methode wurde mit einem einzelnen Konzentrationsdetektor wie ultraviolettem (UV) durchgeführt.  

< Malvern Viscotek SEC-MALS 20 System > 

Aber nun können Sie das Proteinmolekulargewicht unabhängig von der Aufenthaltszeit messen, indem Sie Streulichtdetektoren und Konzentrationsdetektoren (UV oder Brechungsindex, RI) gleichzeitig nutzen. Da die meisten Proteine keine kugelförmige Struktur haben und das gemessene Molekulargewicht daher ungenau sein kann, ist dies eine äußerst nützliche Technik.  Mit der Hinzufügung eines zweiten Konzentrationsdetektors wie IV (intrinsische Viskosität) oder DLS (dynamische Lichtstreuung) kann die Menge an Informationen, die aus einer einzigen SEC-Messung verfügbar sind, deutlich erhöht werden.

Das Malvern Viscotek SEC-MALS 20 System verfügt über 20 Detektionswinkel und ermöglicht die Messung des Proteinmolekulargewichts unabhängig vom Elutionsvolumen.  Diese Anwendungsnotiz beschreibt die Trennung verschiedener Proteine mit SEC. 

Zusätzlich wird der Unterschied in den Ergebnissen diskutiert, nachdem das Molekulargewicht mit MALS (Multi Angle Light Scattering: Mehrwinkel-Lichtstreuung) oder konventioneller Kalibrierung gemessen wurde.