Hydrodynamischer Radius – Gyrationsradius

Größe ist wichtig: Hydrodynamischer Radius vs. Gyrationsradius (Rh versus Rg)

Willkommen zum zweiten Teil der Blogserie, die sich an unser erfolgreiches C&EN-Webinar über die qualitative und quantitative Analyse von Proteinen anschließt.

In dieser Blogserie gehen wir auf einige der interessanten Fragen ein, die von den Teilnehmern gestellt wurden. Heute betrachten wir den Unterschied zwischen hydrodynamischem Radius (Rh) und Gyrationsradius (Rg) und was sie für die Proteinkarakterisierung bedeuten.

Von den vielen Parametern, die die Größe eines Moleküls beschreiben, werden am häufigsten der hydrodynamische Radius (Rh) und der Gyrationsradius (Rg) verwendet. Beide Parameter geben an, wie groß oder klein Ihr Molekül ist, verwenden jedoch unterschiedliche Methoden zur Ermittlung eines Größenwerts…und, vielleicht verwirrenderweise, sind ihre Ergebnisse nicht identisch, doch keines ist falsch!

Rh, gemessen durch Dynamische Lichtstreuung, wird definiert als der Radius einer äquivalenten harten Kugel, die sich mit der gleichen Rate wie das beobachtete Molekül diffundiert. In Wirklichkeit existieren Lösungen von Proteinen und ihren Komplexen nicht als harte Kugeln, und daher spiegelt der ermittelte hydrodynamische Radius eher die scheinbare Größe des solvatisierten, taumelnden Moleküls wider. Rg hingegen wird definiert als der massengewichtete durchschnittliche Abstand vom Kern eines Moleküls zu jedem Massenelement im Molekül. Für Makromoleküle mit Radien größer als 10 nm wird Rg klassisch mit Hilfe der Mehrwinkel-Lichtstreuung bestimmt; eine Technik, die auf der Messung eines Unterschieds in der Intensität des gestreuten Lichts bei unterschiedlichen Winkeln oder auch als Winkeldependenz bekannt, beruht. Moleküle mit Radien kleiner als 10 nm – die den Großteil der bekannten Proteine ausmachen – streuen Licht gleichermaßen in alle Richtungen (Rayleigh-Streuer) und zeigen daher keine Winkeldependenz. Folglich kann Rg nicht auf diese Weise für Proteine bestimmt werden. Es ist jedoch möglich, Rg für Proteine und kleine Moleküle mit anderen Techniken wie Kleinwinkelneutronenstreuung (SANS) und Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) oder aus hochauflösenden Röntgenstrukturen zu erhalten.

Für Proteine und ihre Komplexe werden Rg und Rh immer in derselben Größenordnung liegen, aber was bedeuten diese Größenparameter wirklich für die Proteinkarakterisierung? 

Um diese Frage zu beantworten, müssen wir uns drei Schlüsselbereiche der Proteinkarakterisierung ansehen. In erster Linie bietet die Möglichkeit, die Größe zu messen, eine einfache Möglichkeit zur Bestätigung der Identität und des oligomeren Zustands eines Proteins in einer Zubereitung, vorausgesetzt, es gibt a priori Kenntnisse über dessen monomere Größe. Daher ist leicht zu erkennen, wie Size-Screening in Proteinproduktionslabors implementiert werden könnte, um relevante Fraktionen von gereinigtem Protein zu identifizieren oder die Konsistenz von Formulierungen von Charge zu Charge zu überprüfen.

Zum zweiten finden biologische Prozesse in Lösungen statt; daher ist das Interesse an der Untersuchung und Charakterisierung von Proteinen fest in dem Verständnis und letztlich der Kontrolle des Proteinverhaltens verwurzelt. Es wird angenommen, dass, wenn man das Verhalten von Proteinen in Lösung versteht, die Wechselwirkung mit anderen Biomolekülen, Medikamenten und untereinander vorhergesagt werden kann. Diese Informationen können dann genutzt werden, um Proteindösungen so zu manipulieren, dass ein bestimmtes Ergebnis erzielt wird, z.B. die Entwicklung von Formulierungen. Daraus wird deutlich, dass Rh ein biologisch relevanter Parameter ist, da er die Protein-Größe im Kontext seiner Umgebung berücksichtigt.

Sowohl Rg als auch Rh können verwendet werden, um Einblicke in den dritten wesentlichen Bereich der Proteinkarakterisierung zu gewinnen: die Struktur. Die Art und Weise, wie Rg berechnet wird, bedeutet, dass der Wert selbst etwas mehr von der Struktur des interessierenden Moleküls abhängt als der Wert von Rh. Aber es ist das Verhältnis von Rg zu Rh (Rg/Rh), das wirklich Informationen über die Form eines Proteinmoleküls liefert. Der charakteristische Rg/Rh-Wert für ein globulares Protein liegt bei ~0.775, was bedeutet, dass Rg kleiner als Rh ist. Weichen jedoch Moleküle von globulären zu nicht-sphärischen oder verlängerten Strukturen ab, tendiert Rg/Rh zu Werten über 0.775, da Rg größer als Rh wird.

Experimentell ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass für Proteine Rg nicht durch statische Lichtstreuungstechniken erhalten werden kann und dass Rh eine alternative Methode zur Forminformation durch die Perrin-Theorie bieten kann.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Rg und Rh-Werte nicht austauschbar verwendet werden sollten, da jeder eine andere Perspektive auf das in Frage stehende Protein bietet. Neben dem Wert der von der Molekülgröße gelieferten Informationen müssen viele Merkmale der Messung selbst berücksichtigt werden, z.B. Analysezeit, Konzentration, Probenvolumen, Budget, um den tatsächlichen Nutzen für den Benutzer zu bestimmen.

Bald verfügbar…

Halten Sie Ausschau nach dem nächsten Teil dieser Blogserie, in dem wir den Aggregationspunkt beleuchten und seine Beziehung zur Stabilität von Proteinen und biotherapeutischen Formulierungen erörtern.