Auf dem Weg zum Kalorimetriemeister Vol.8
RNase A mit DSC messen! Teil 2

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Die in diesem Artikel vorkommenden Personen und Geschichten sind fiktiv.
Technischer Inhalt: Prof. Fukada, Gastwissenschaftler an der Universität Osaka, hat uns mit Hinweisen unterstützt.

Den im Text erwähnten VP-DSC-Analyseleitfaden kann man über den „Download“-Button unten herunterladen.

(Fortsetzung von Teil 1)

Die Basislinie der Kontrollmessung ist stabil. Sobald es etwa 30 °C erreicht, entferne den Druckdeckel, um die Probe zu füllen. Vakuumiere die Probe mit dem ThermoVac und einem Timer. Nachdem das Vakuum abgeschlossen ist, entferne den Druckdeckel und setze den Druckstopfen in den Drucksensor. Dieses Mal verwenden wir keinen Fülltrichter, sondern stecken vorsichtig eine an eine Luer-Spritze angeschlossene Nadel ein, ohne den Boden zu berühren, und entfernen das Puffergemisch aus der Probenzelle. Die vakuumierte Probe ist jetzt bereit. Der PreScan-Thermostatprozess von 15 Minuten ist abgeschlossen und das Finale Gleichgewicht wird erreicht. Der DP-Wert nähert sich nahezu Null, also ist das in Ordnung!

Herr Nakamura. Läuft alles gut?

	Ja, der DP-Wert scheint in Ordnung zu sein. Jetzt müssen wir nur auf die Messergebnisse warten.

Haben Sie übrigens die Anzahl der Scans geändert?

	Oh, das habe ich vergessen. Also ändere ich die Zahl auf 11 und klicke auf „Update Run Param.“ – das war knapp.

	Es ist kein Problem, dies zu tun, auch nachdem die Messung begonnen hat. Aber es ist natürlich immer beruhigend, wenn man keine Änderungen vornimmt, während Daten gesammelt werden.

Das werde ich mir merken.

	Herr Nakamura, wir haben ziemlich gute Daten erhalten.

Danke. Aber die Basislinie steigt an. Das war auch bei der Wasser-Wasser-Messung der Fall. Ist das ein Problem?

	Es wird angenommen, dass diese Steigung darauf zurückzuführen ist, dass das Volumen der Probenzelle und der Referenzzelle nicht genau identisch ist. Dies ist ein unvermeidbares, systembedingtes Driften. Aber in DSC-Experimenten zieht man immer die Daten der Kontrollmessung von den Probenmessdaten ab, also hebt sich das Driften im besten Fall auf, wenn gleiche Bedingungen herrschen.

Also hängt die Qualität der Daten von der Übereinstimmung der Steigung der Basislinien ab.

	Genau.

Wenn die Steigungen nicht übereinstimmen, könnte das darauf hindeuten, dass Luftblasen in die Zelle eingetreten sind, oder?

	Genau. Wenn die Basislinienreproduzierbarkeit schlecht ist, sollten Sie zunächst Blasenverdacht hegen. Diese Blasen können auch durch verschmutzte Zellen verursacht werden.

	Sowohl bei ITC als auch bei DSC ist es wichtig, die Zellen sauber zu halten.

	Ja, die Reinheit der Zellen ist sehr wichtig. Auch wenn die Pufferzusammensetzung variiert, kann dies zu einer Drift der Basislinie führen, daher bitte aufpassen.

	Ein weiterer Punkt: Wichtig ist, dass die Antwort der Probe unterhalb der Antwort des Kontrollen liegt. Das ist diesmal auch so.

Ja, das ist richtig, aber warum ist das so?

	Wenn man die Kontrolllösung, also den Puffer, mit der Probenlösung vergleicht, enthält die Probe Protein, was bedeutet, dass die Konzentration der Wassermoleküle geringer ist. Da die Wärmekapazität von Wasser höher ist als die des Proteins, wird durch höhere Wasseranteile mehr Wärme erzeugt.

Also, wenn die Probe unerwartet höher wäre, was könnte die Ursache sein?

	Es könnte vorkommen, wenn die Pufferzusammensetzung leicht unterschiedlich ist.

	Dann werde ich das System reinigen und herunterfahren.

Gute Arbeit. Jetzt folgt die Analyse.

	Ja, ich werde es zunächst gemäß dem Handbuch tun.

Oh, das Icon fehlt auf dem Desktop…

	Je nach Zeitpunkt des Kaufs könnte Ihr System statt eines MicroCal, LLC DSC-Icons ein MicroCal Analysis Launcher-Icon auf dem Desktop haben. In diesem Fall bitte doppelklicken und unter MicroCal Data Analysis den VP-DSC auswählen. Die weiteren Schritte gemäß Handbuch ausführen.

Ach ja, wir haben 10 Scans von den Kontrollmessungen. Welchen sollte ich wählen? Normalerweise würde man den nehmen, der der Probenmessung am nächsten liegt, nicht wahr?

Herr Nakamura, wie geht es Ihnen?

Die Kontrollen haben 10 Scans. Sollte ich in so einem Fall den zehnten nehmen, da er der Probe am nächsten ist?

Ja, durch wiederholte Scans wird die Reproduzierbarkeit verbessert, daher reicht in diesem Fall der 10. Scan. Wenn jedoch in der letzten Kontrolle Spike-Rauschen auftritt, wählen Sie den davor liegenden Scan.

	Verstanden. Dann werde ich die Dateien vom 11. Proben- und 10. Kontrollscan aufrufen.
	Hinweis: Im Analyse-Software ist mit Kcal/mole ausgezeichnet, korrekt wäre jedoch kcal/mol.

Herr Nakamura, die Analyse scheint auch in Ordnung zu sein.

Ja, so scheint es, aber es gibt zwei Ergebnisse für ΔH. Warum unterscheiden sich die Werte leicht, und welchen sollte ich verwenden?

Herr Nakamura, das haben Sie doch schon einmal gefragt?

???

Es geht um den Unterschied zwischen kalorimetrischer Enthalpieänderung (ΔHcal) und Van’t Hoff-Enthalpieänderung (ΔHvh).

	Ah, das habe ich vergessen!

Der Wert mit einem kleinen v unter ΔH ist die Van’t Hoff-Enthalpieänderung. Da die Werte diesmal annähernd gleich sind, bedeutet dies, dass RNase A ein Zwei-Zustands-Übergangsprotein ist.

Genau, das wäre dann so. Dann können Sie für diese Art von Probe auch eine Analyse mit einem Zwei-Zustands-Modell durchführen.

	By the way, Herr Professor. Das Test Kit erwähnt ausdrücklich „Integrate from 0“ als Datenanalysenmethode. Was bedeutet so etwas?

Die Analyse-Software ermöglicht es, den Beginn des Integrationsbereichs festzulegen, nachdem die Basislinie abgezogen wurde, um die Enthalpieänderung und Tm zu berechnen.

	Zur Erläuterung: „Integrate from 0“ ist nicht im japanischen Kurzanleitung erwähnt. Erst wird die Basislinie abgezogen, dann wird das Areal unter dem Peak verwendet. Bei dieser Methode wird die tatsächliche Fläche genutzt, aber bei der Fitting-Methode das durch Fitting erhaltene Flächenresultat (die roten Linien). Der endgültige Tm entspricht der Temperatur, bei der die halbe Fläche erreicht ist.

Oh!? Tm und NDH weichen von den Werten vom Fitting ab!

	Tm bei „Integrate from 0“ ist der Spitzenwert des Peaks, während es beim Fitting die Temperatur ist, bei der die Fläche halbiert wird. NDH ist bei „Integrate from 0“ die tatsächliche Fläche, aber beim Fitting basiert es auf der durch Fitting erhaltenen Fläche. Schauen Sie sich die Diskrepanz zwischen experimentellen Werten und der Fitting-Kurve an?

Ja, das stimmt. Aber bis zu welchem Punkt ist diese Abweichung akzeptabel?

Die Antwort von Malvern lautet, dass alles innerhalb eines SE von 2 % kein Problem ist.

Da ΔH bei 1.026E5 cal/mol (1.02 kcal/mol) liegt, bedeutet eine 2 %-Spanne 2052 cal/mol. 409 cal/mol liegen also innerhalb des akzeptablen Bereichs.

Genau so ist es.

Lassen Sie mich ergänzen: Bei unseren früheren Anleitungen von Herrn Nakamura erwähnten Fragen, ob Parameter durch Fitting oder eine andere Methode bestimmt werden sollten, überlassen wir es dem Forscher. Beim Zwei-Zustands-Übergang sind die Ergebnisse von Fitting- und „Integrate from 0“-Methode meist ähnlich, weil solche Proben tendenziell symmetrische Peaks aufweisen. Daher ähneln die Tm der Peaks. Nicht-Zwei-Zustands-Übergänge weisen jedoch nicht immer symmetrische Peaks auf. So ist es entscheidend, die gleiche Methodik kontinuierlich zur Analyse zu verwenden, um Vergleiche zu ermöglichen.

Den im Text erwähnten VP-DSC-Datenanalyseleitfaden kann man über den „Download“-Button unten herunterladen.
(Gleich wie der „Download“, der von Teil 1 heruntergeladen werden kann.)

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