Der Weg zum Kalorimeter-Meister Vol.2 Fortsetzung
Mal sehen, wie man das isothermische Titrationskalorimeter iTC200 benutzt!
※Am Ende dieses Artikels können Sie das Material herunterladen.
Endlich besuchte Herr Nakama das Büro von Professor Fukada. 
Professor Fukada! Lange nicht gesehen!! Geht es Ihnen gut?
Herr Nakama, schön, dass Sie da sind. Ich habe Sie erwartet. Wie lange ist es her?
Haha. Es scheint, dass Sie nun ITC und DSC verwenden werden.
Ja, genau! Ich freue mich darauf. Als ich Student war, hatte ich Professor gesehen, dass Sie Messungen durchführten, aber ich hätte nie gedacht, dass ich selbst einmal messen würde.
Haha. So ist das Leben. Also, wo sollen wir anfangen?
Ich habe in der Firma das iTC verwendet, aber es hat nicht so gut geklappt…also habe ich einige Fragen zusammengestellt.
Oh, das ist gut vorbereitet. Lassen Sie es uns ansehen.
Professor Fukada überprüfte Herr Nakas Notizen.
Herr Nakama, haben Sie das System schon lange nicht genutzt?
Hohe DP und ein Anstieg des Basislinienrauschens sind Anzeichen dafür.
Es half nicht das Wasser in der Referenzzelle auszutauschen?
Ich denke, Sie sollten gründlich reinigen.
Zukünftig ist Reinigung sehr wichtig.
Ich reinige immer die Zellen und Spritzen mit Reinigungsmittel und ultrapurem Wasser nach jeder Messung.
DP-Werte über dem Referenzpuder war also kein Gasbläschen, sondern…
Das ist höchstwahrscheinlich der Fall.Es wäre ratsam, die Zellen bei der Reinigung mit 20 % Contrad 70 oder 14 % Decon 90 zu erhitzen. Es sollte eine Anleitung dazu im Handbuch geben.
Oh ja, hier ist es! (Handbuch P41 und Hinweis 1)
(Hinweis 1) Falls Sie VP-ITC verwenden, beachten Sie Handbuch P.45. Um die Jackentemperatur zu ändern, geben Sie die Temperatur im Thermstat/Calib-Tab im Set Point (℃) ein und klicken Sie auf Set Jacket Temp.
Bei niedrigem DP glaube ich, dass es ein Gasbläschen in der Probenzelle gibt. Wie verhindert man das Eindringen von Bläschen in die Zelle?
Beim Einspritzen einer Lösung sollten Sie ca. 350 μL in die Spritze ziehen und die Nadel langsam nahe am Boden der Zelle einführen. In den meisten Fällen reicht das aus, aber bei kleinen Mengen, z.B. um 50 μL, sollten Sie pumpen, um Konvektion zu erzeugen, die Bläschen herausdrücken kann.
Da das Leitungssystem vor der Zelle etwa 50 μL Flüssigkeit hält, überschreiten Sie diese Menge nicht beim Pumpen, da sonst Bläschen, die ausgetrieben wurden, wieder eingeschleust werden können. Seien Sie auch vorsichtig, indem Sie die Spritze langsam in der Zelle vertikal schwenken, um Bläschen an der Verbindung von Zelle und Leitung zu beseitigen.
Und, was wichtig ist: Wenn die Lösungstemeratur unter der Messtemperatur liegt, erwärmen Sie die Lösung vorab. Bei iTC200 kommt die Herstellerangabe, dass Entgasen nicht nötig ist (Hinweis 2).
Mit der Zeit und Übung bekommen Sie ein Gespür dafür, seien Sie geduldig.
(Hinweis 2) Für VP-ITC-Anwender ist Entgasen vor der Messung notwendig.
Zum Referenzteil: Warum genügt ultrapures Wasser? Im Experiment sollte das Puffer übereinstimmen, oder?
Die Referenzzelle benötigt eine Lösung mit derselben Wärmekapazität, um Temperaturschwankungen von außen abzuleiten.Wasser hat eine sehr große Wärmekapazität, und der Hauptinhalt einer jeden Lösung ist Wasser, nicht wahr? Daher reicht Wasser in der Referenzzelle aus.
Der Wasserwechsel in der Referenz reicht einmal wöchentlich, aber bei hohen Temperaturen kann ein häufigerer Wechsel erforderlich sein, da etwas Wasser verdampft.
Ok, das verstehe ich.
Professor, kann ich zum Schluss noch eine Frage stellen?
Fragen Sie ruhig alles, was Sie wollen.
Vielen Dank! In Bezug auf die Konzentrationseinstellung für die Probemessung, das Handbuch erwähnt den C-Wert. Ich kann es mir nicht so richtig vorstellen.
Zur Erläuterung: Der C-Wert ist ein Richtwert zur Bestimmung der Zellkonzentration, die benötigt wird, um eine gute Sigmoidkurve für die Analyse zu erhalten.
Mit dem Simulationstool, das Teil der Steuerungssoftware des iTC200 ist, können Sie die Einstellungen leicht anpassen.Aber allgemein gesagt, Protein-Konzentrationen von um die 10 μM werden oft verwendet, müssen aber je nach Bindungsstärke angepasst werden.
Wenn man den C-Wert für hochaffine Interaktionen als Basis nimmt, kann die Zellkonzentration sehr niedrig sein.
Wenn Sie beispielsweise eine Dissoziationskonstante von 10 nM nutzen, um den C-Wert bei 5 zu halten, können Sie 50 nM als Zellkonzentration berechnen.
Aber bei der tatsächlichen Messung bei dieser Konzentration besteht die Möglichkeit, dass nicht genug Wärme freigesetzt wird. Es wäre besser, mindestens 1 μM (Hinweis 3) zu verwenden. Eine genaue Konzentrationsinformation ist auch sehr wichtig, lassen Sie uns darüber später reden. Zur Zeit bestimmen Sie die Proteinkonzentration am besten anhand des UV-Absorptionsspektrums um 280 nm.
Probieren Sie es aus. Beginnen wir mit einer CaCl2 und EDTA Übung.
(Hinweis 3) Die durch Interaktionen entstehende Wärmemenge variiert. Manchmal reicht 1 μM, aber bei schwachen Änderungen sollte die Zellkonzentration erhöht werden.
Im nächsten Kapitel werden wir die tatsächlich erhaltenen Daten überprüfen und lernen, wie man die Daten analysiert und bei Problemen handelt.
Bleiben Sie gespannt!
Um diesem Artikel mehr Authentizität zu verleihen, beobachtete ich einen realen ITC-Messvorgang durch Professor Fukada.
Das verwendete System war OMEGA, das seit 1987 existiert. Es ist erstaunlich, dass ein fast 30 Jahre altes System noch in Betrieb ist. Ich sah es zum ersten Mal richtig in Aktion. Der verwendete PC hatte Windows 3.1! Keine USB-Ports natürlich. Am meisten überraschte mich, dass die Systemzellen nie kaputt gingen und nur der Rührmotor und die PC-Platine repariert wurden.
Professor Fukada hatte ein exzellentes Verständnis vom System, fand heraus, wie man es trotz Handbuch durch eigene Methoden erweitern konnte und hielt gründlich an Reinigungsstandards nach jeder Messung fest.
Ich möchte weiterhin die wertvollen Einblicke und das Know-how, das ich von Professor Fukada erhalten habe, mit Ihnen teilen.
Informationen zur Geschichte von MicroCal ITC finden Sie im britischen Malvern-Blog. Der Blog des britischen Malvern-Hauptquartiers hier!
