Auf dem Weg zu einem Kalorimeter-Meister Vol.4

Als Nächstes sollten wir die Messung von Protein und Verbindung ausprobieren. Da wir die Affinität nicht genau kennen, messen wir das Protein bei 10 μM und die Verbindung bei 100 μM nach der üblichen Methode.

Es zeichnet keine sigmoide Kurve. Vielleicht habe ich die Konzentration falsch eingestellt… Die Wärme des Kontrollverdünnungsprozesses ist bei jeder Titration fast gleich. Da der DP-Wert bei 0,015 μcal/sec liegt, ist er klein. Außerdem ist die Wärme bei der letzten Titration der Probe kleiner als diese. Das bedeutet, dass die Wärmeentwicklung der Probe sehr gering ist. Ist es in Ordnung, dies einfach abzuziehen…

Nakamura-san, Sie scheinen ein Problem zu haben.

Fukada-sensei, genau. Ich habe Protein und Verbindung gemessen, aber es zeichnet keine sigmoide Kurve und die erhaltene Wärme scheint sehr gering zu sein.

Das scheint so zu sein. Haben Sie vor der Messung eine Simulationssoftware verwendet, Nakamura-san?

Ah, das ist das, was Sie uns schon einmal über die mit der iTC200-Steuerungssoftware gelieferte Software erzählt haben. Entschuldigung, ich habe es nicht verwendet…

Es ist im Handbuch beschrieben. Wie wäre es, wenn Sie die Seite P.39 nachlesen?

Okay, ich werde es überprüfen.

Und die aktuelle Probe scheint eine relativ schwache Affinität zu haben.

Ja, ich vermute, es ist ungefähr einige μM.

Wie haben Sie die Konzentration eingestellt?

Wir haben es mit 10 μM Protein und 100 μM Verbindung versucht.

Was passiert, wenn Sie K_D auf 5 μM einstellen und eine Simulation durchführen?

Ah, jetzt zeichnet es eine sigmoide Kurve. Allerdings ist die Konzentration höher eingestellt als die, die ich verwendet habe.

Ja, das ist die vom Simulationssoftware empfohlene Messkonzentration. Was passiert dann, wenn Sie die Konzentration simulieren, die Sie verwendet haben?

Ich habe mit 10 μM Protein und 100 μM Verbindung gearbeitet…

Oh nein! Es zeichnet keine sigmoide Kurve!!

Ja. Wenn, wie in diesem Fall, der vorausgesagte K_D bereits bekannt ist, ist es ratsam, vor der eigentlichen Messung eine Simulation durchzuführen und zu überprüfen.

Verstehe. Die Simulationssoftware ist wirklich nützlich!

Jetzt eine Frage: Dies sind ITC-Daten für Bovine Carbonic Anhydrase, mit der niedermolekularen Verbindung Sulfanilimide und AMBSA. Was denken Sie über diese Daten?

Das obere Diagramm für Sulfanilimide scheint eine Art sigmoide Kurve zu zeichnen, aber das untere Diagramm für AMBSA ist linear und zeigt keine sigmoide Kurve.

Das stimmt. Was glauben Sie, könnte man tun, um eine sigmoide Kurve zu zeichnen?

Hmm… Ich konnte vorhin keine sigmoide Kurve zeichnen, als die Konzentration gesenkt wurde, also sollte ich die Konzentration erhöhen?

Ja. Übrigens wird gesagt, dass das K_D für Sulfanilimide etwa 8 μM ist, und für AMBSA etwa 10 μM.

Man sollte eine Simulation durchführen.

Mit der in der vorherigen Abbildung gezeigten Konzentration könnte man keine sigmoide Kurve zeichnen. Aber, Sensei, die Simulationsergebnisse zeigen, dass die Zellkonzentrationen relativ hoch eingestellt sind. Was macht man, wenn es schwierig ist, diese Konzentration vorzubereiten?

Erinnern Sie sich an den Einstellbereich des C-Werts, Nakamura-san?

Einstellbereich?

Sehen Sie im Handbuch nach. In welchen Bereich wird als wünschenswert beschrieben?

Ah, es heißt, ein Bereich von 5 bis 250 ist ideal und 1 bis 1000 ist akzeptabel. (Siehe das Einfachleitfaden auf S.7–8)

Genau. Mit der Simulationssoftware können Sie auch den C-Wert ändern. Es ist auch möglich zu simulieren, was passiert, wenn Sie mit der tatsächlich präparierten Probendichte messen.

Ich verstehe! Das ist also experimentelles Design.

Genau so ist es. Nakamura-san, da Sie in Zukunft möglicherweise Messungen an Verbindungen mit noch niedrigerer Affinität durchführen müssen, werde ich Ihnen die Mess- und Analysepunkte für solche Experimente erläutern.

Ja! Bitte, erklären Sie mir das!

Was denken Sie über diese Daten, Nakamura-san? Es geht um die Wechselwirkung zwischen Protein und Fragment…

Da keine sigmoide Kurve gezeichnet ist, würde ich die Konzentration erhöhen und eine Messung durchführen, oder?

Wenn das Experiment durchgeführt wurde, indem die Proteinkonzentration in der Zelle auf 30 μM und das Fragment auf 3 mM eingestellt wurde, was passiert dann?

Was? Ist die Fragmentkonzentration so hoch? Während die Proteinkonzentration der Zelle nicht besonders hoch ist…

Gehen wir zurück zum Handbuch. Seite 9. Dies beschreibt das experimentelle Design für Affinitäten, die schwächer als 100 μM sind.

Es zeichnet keine sigmoide Kurve.

Ja. Wenn die Affinität sehr schwach ist, ist es oft nicht möglich, eine sigmoide Kurve zu zeichnen, ohne dass Schwierigkeiten bei der Einstellung der Konzentration auftreten. Können Sie bitte eine Simulation durchführen?

Oh! Ein 1 mM Protein ist definitiv unmöglich!

Richtig. Bei solcher Vorgehensweise stellen Sie, wie im Handbuch beschrieben, die Proteinkonzentration auf 1/5 bis 1/100 des vorhergesagten K_D, halten jedoch mindestens 10 μM aufrecht, und führen die Titration mit einer Verbindungskonzentration von 10 bis 50 Mal K_D bei einigen mM durch. Dabei stellen Sie sicher, dass am Ende der Messung die Bedingung ist, dass das Protein vollständig gesättigt ist. Schauen Sie sich die Achse des Molverhältnisses auf den normalisierten Plotdaten der vorangegangenen Daten an. Sie sehen, dass dort ein hoher Wert angezeigt wird, oder?

Ja, aber das ergibt keine sigmoidale Kurve…

Ja. In diesem Zustand ist sowohl eine Bindung als auch eine Änderung der Enthalpie nicht möglich. Daher ist eine zusätzliche Anpassung bei der Analyse notwendig.

Eine zusätzliche Anpassung?

Ja. Im Handbuch steht, dass die Analyse durchgeführt wird, indem ein „angenommener Bindungswert“ eingesetzt wird. Wenn die gemessene Probe eine Bindung von 1:1 zeigt, dann kann der Bindungswert theoretisch als „1“ angenommen werden, oder?

Ja, theoretisch…

Der Bindungswert entspricht dem Wendepunkt in einer sigmoidalen Kurve. Wenn Sie bei der Anpassung „1“ als konstanten Wert bei den anfänglichen Werten eingeben, können Sie eine Anpassung vornehmen. Wenn das Fitting Session Fenster erscheint, geben Sie „1“ für den N-Wert ein und deaktivieren Sie das Häkchen „Vary?“. Dadurch wird es als Konstante in der Analyse gesetzt. Die Software kann dann die erhaltene Kurve als Teil einer sigmoidalen Kurve verwenden, wobei der Punkt des Molverhältnisses als Wendepunkt dient, um die sigmoide Kurve zu simulieren. Dadurch können K_D und ΔH ermittelt werden.

Ich verstehe!

Bitte beachten Sie jedoch, dass dies voraussetzt, dass die Probendichte 100% aktiv gehalten wird.

Ja!

So konnte Nakamura-san die eigentliche Probemessung durchführen. Sie lernte, dass es Probenzubereitung, Messbedingungen und -methoden gibt, die den Eigenschaften jeder Probe entsprechen. Wenn ungewöhnliche Reaktionen auftreten, wird nicht versucht, sie auf Biegen und Brechen zu analysieren, sondern Sie sollten überlegen, wie es eigentlich sein sollte. Und wenn es nicht so ist, sollten Sie nach den möglichen Gründen suchen. In der nächsten Ausgabe werde ich Methoden zur Interpretation und Reaktion auf unregelmäßige Daten vorstellen.

【Hinweis】
Was glauben Sie, welche Frage am meisten zu ITC gestellt wird? Die Antwort ist „Die Lösung fließt beim Reinigen der Titrationsschlaufe nicht“. Tatsächlich behandeln wir dieses Problem im Vol. 2 des Wegs zum Kalorimeter-Meister.

Schäden an den Titrationsschlauch aus Glas, schlechte Verbindung des Fillportadapters, Verschlechterung von O-Ringen etc. sind mögliche Gründe, aber neuerdings gibt es andere Gründe, die Probleme verursachen können.

Dazu gehört eine Verstopfung des Filters auf der Rückseite des Washing Modules.

Durch Austausch dieses Filters können die Probleme gelöst werden. Wenn die Anleitung zur „Behebung des Problems, dass Reinigungswasser nicht durch die MicroCal iTC200 Titrationsschlauch fließt“ das Problem nicht löst, ersetzen Sie bitte diesen Filter. Beachten Sie dabei, dass der Filter beim Systemlieferumfang dabei ist.

Je nach Lieferzeitpunkt sind diese Filter möglicherweise im Inneren des Washing Node eingebaut, und könnten wie in den Bildern unsichtbar sein. In diesem Fall empfehlen wir, unseren technischen Support zu kontaktieren, da der Austausch selbst schwierig sein kann.