Welcher Lichtstreudetektor ist der beste für mich?

Die Entscheidung, welches Gelfiltrations/Größenausschlusschromatographie (GPC/SEC) System am besten für Ihre Bedürfnisse geeignet ist, kann eine entmutigende Aufgabe sein. Selbst nachdem Sie sich entschieden haben, einen Lichtstreudetektor einzuschließen, um absolute Molekulargewichtsdaten zu erhalten, müssen Sie immer noch zwischen zwei Optionen wählen: einem Multiwinkel-Lichtstreu (MALS) Detektor oder einem rechten und niedrigen Winkel-Lichtstreudetektor (RALS/LALS). Beide Lichtstreukonfigurationen liefern das absolute Molekulargewicht einer Probe, nutzen jedoch unterschiedliche Ansätze für dieses gemeinsame Ziel. Glücklicherweise bietet Malvern Panalytical beide an; das modulare SEC-MALS 20 Gerät, das mit OMNISEC, dem TDAmax oder anderen Drittanbietersystemen verbunden werden kann, und einen integrierten RALS/LALS Detektor im OMNISEC und TDAmax-All-inclusive GPC/SEC Systemen anbietet. In diesem Beitrag werde ich die MALS und RALS/LALS Detektoren erörtern und hoffentlich die relevanten Informationen bereitstellen, die es Ihnen ermöglichen, die beste Konfiguration für Sie und Ihre Anwendung zu bestimmen.

Um zu beginnen, machen wir einen Schritt zurück und diskutieren kurz einige Grundlagen der Lichtstreutheorie (für eine detailliertere Diskussion über statische Lichtstreuung, siehe bitte unser zuvor veröffentlichtes Whitepaper zu diesem Thema). Der Grund, warum Lichtstreudetektoren funktionieren, ist, dass die Intensität des von einem Molekül gestreuten Lichts direkt proportional zu seinem Molekulargewicht ist. Je höher das Molekulargewicht, desto größer die Intensität des gestreuten Lichts. Diese Beziehung wird durch die Rayleigh-Gleichung hervorgehoben, die unten gezeigt ist, wo RΘ die Intensität des gestreuten Lichts bei einem gegebenen Winkel Θ darstellt und Mw das Molekulargewicht einer Probe ist.

Zusätzlich spielt der Beobachtungswinkel des gestreuten Lichts eine Rolle. Relativ kleine Proben mit einem Radius von 10-15 nm oder kleiner sind als isotrope Streuer bekannt, was bedeutet, dass sie Licht in alle Richtungen gleichmäßig streuen. Das bedeutet, dass die Intensität des bei 90° Detektor beobachteten Lichts dieselbe ist wie die Intensität des bei einem bei 15°, 45°, 135° usw. platzierten Detektor beobachteten Lichts. Proben, die größer als dieser Bereich von 10-15 nm sind, werden von Interferenz beeinflusst, da die Probe groß genug ist, um das Licht mehrfach zu streuen, bevor es den Detektor erreicht. Das Ergebnis ist, dass die Intensität des gestreuten Lichts für große Proben je nach Beobachtungswinkel variiert. Die Winkeldependenz der Intensität des gestreuten Lichts bedeutet, dass unterschiedliche Molekulargewichte basierend auf der Platzierung des Detektors berechnet werden könnten. Um die Effekte von Interferenz zu minimieren, ist der optimale Beobachtungswinkel für die Intensität des gestreuten Lichts von großen Proben der 0° Winkel. Aus praktischer Sicht ist dies unmöglich, da der Detektor nicht zwischen gestreutem Licht von der Probe und Licht vom einfallenden Strahl unterscheiden könnte. Die Lösungen für dieses Problem – die Beobachtung der Intensität des gestreuten Lichts im 0° Winkel – sind in den MALS und RALS/LALS Detektorkonfigurationen dargestellt.

Ein MALS Detektor verwendet typischerweise irgendwo zwischen drei und zwanzig Detektoren, die in verschiedenen Winkeln um die Probenzelle angeordnet sind. Ein 90° Detektor ist normalerweise enthalten, und die verbleibenden Detektoren können von 12° bis hin zu 168° reichen. Ein MALS Detektor misst die gestreute Lichtintensität bei verschiedenen Winkeln, passt die Daten an ein Modell an und extrapoliert zurück auf 0°, um das Molekulargewicht der Probe zu bestimmen. Wenn die Probe ein isotroper Streuer ist, dann repräsentiert jeder Datenpunkt die gleiche Streuintensität, und die Extrapolation zurück auf 0° wird eine gerade Linie sein. Wenn die Probe groß genug ist, um Winkeldependenz zu zeigen, werden die Unterschiede in der gestreuten Lichtintensität basierend auf dem Beobachtungswinkel sichtbar. Beide Beispiele sind in den partiellen Zimm-Plots unten gezeigt.

Partielle Zimm-Plots, die verschiedene Winkel eines MALS-Antworts zeigen; Links: eine Probe, die isotropes Streuen mit gleicher Intensität bei allen Winkeln zeigt; Rechts: eine Probe, die Winkeldependenz zeigt, wie durch die Steigung des Plots belegt

Die RALS/LALS Detektoranordnung besteht aus 90° und 7° Detektoren, die aufgrund ihrer komplementären Natur sorgfältig ausgewählt wurden. Für Proben mit einem Radius von 10-15 nm und kleiner ist der 90° Detektor ideal, da er in einem rechten Winkel zum einfallenden Strahl positioniert ist, was das Signal-Rausch-Verhältnis maximiert. Da kleinere Proben Licht mit gleicher Intensität in alle Richtungen streuen, bietet der RALS Detektor die ideale Antwort für eine direkte Messung des Molekulargewichts einer Probe. Für Proben mit einem Radius größer als dieser Bereich von 10-15 nm, der Winkeldependenz zeigt, bietet der LALS Detektor eine Messung bei 7°, was die niedrigste verfügbare Detektorposition ist. Die Platzierung bei 7° bedeutet, dass der Detektor praktisch eine direkte Messung des Molekulargewichts der Probe durchführt und die Notwendigkeit für Anpassungen und Extrapolationen vermeidet. Es ist wichtig zu beachten, dass der LALS Detektor für Proben jeder Größe genau ist, jedoch aufgrund der niedrigeren Intensität des gestreuten Lichts, die von kleineren, niedrigeren Molekulargewichtsproben geliefert wird, der RALS aufgrund seiner orthogonalen Platzierung zur einfallenden Lichtquelle ein saubereres Signal liefert.

Partielle Zimm-Plots, die die direkte Messung des Molekulargewichts zeigen; Links: die 90° RALS Antwort für die Messung einer Probe, die isotropes Streuen zeigt; Rechts: die 7° LALS Antwort für die Messung einer Probe, die Winkeldependenz zeigt

Um den am besten geeigneten Lichtstreudetektor für Ihre Bedürfnisse zu bestimmen, müssen Sie Ihre Anwendung, die Informationen, die Sie suchen, und Ihre persönlichen Vorlieben berücksichtigen. Sowohl MALS als auch RALS/LALS Detektoren haben Vor- und Nachteile, die sie für eine Situation oder eine andere besser geeignet machen, aber die gute Nachricht ist, dass beide genaue Ergebnisse liefern können!

Zum Beispiel, wenn Ihr Hauptanalyseziel eine relativ große Probe mit hohem Molekulargewicht ist, sind sowohl die MALS als auch die RALS/LALS Detektorkonfigurationen darauf ausgelegt, das gesamte Spektrum der in Ihrer Probe vorhandenen Molekulargewichte zu bearbeiten. Wenn Sie jedoch hauptsächlich daran interessiert sind, kleine, niedrige Molekulargewichtsproben zu analysieren, kann ein RALS Detektor die Mehrheit Ihrer Analysen bewältigen. Ein ergänzender LALS Detektor stellt sicher, dass alle großen Fraktionen Ihrer Probe oder potenzielle Aggregate genau beobachtet werden, selbst wenn sie in geringer Konzentration innerhalb Ihrer Probe existieren. Ein MALS Detektor kann das korrekte Molekulargewicht bestimmen, aber da alle Detektoren dieselbe Intensität des gestreuten Lichts für die kleinen, isotrop streuenden Proben beobachten werden, kann es potenziell redundant werden, dasselbe Ergebnis mehrfach zu erhalten.

Das obige Beispiel ist häufig der Fall für Wissenschaftler, die Proteine untersuchen. Aufgrund der geordneten Natur ihrer Strukturen sind Proteine relativ dichte Moleküle, was bedeutet, dass selbst hochmolekulare Spezies vergleichsweise klein sind. Sogar Proteine mit Molekulargewichten von bis zu 700 kDa haben nur einen Radius von 10-12 nm. Das Potenzial für hohe Molekulargewichte, aber relativ kleine Molekülgrößen bedeutet, dass Proteine typischerweise isotrope Streuer sind und ideale Proben für einen RALS/LALS Detektor sind. In diesem Fall wäre der RALS Detektor der Hauptdetektor, der für Berechnungen verwendet wird, während der LALS Detektor Aggregate oder größere Komponenten in der Probe aufnimmt. Da Proteine generell isotrope Streuer sind, gibt es keinen zusätzlichen Vorteil, dass es viele Detektoren in verschiedenen Winkeln gibt, die in einem MALS Detektor enthalten sind.

Um diesen Punkt zu veranschaulichen, wurden die Molekulargewichte mehrerer Proteine mit sowohl einem RALS als auch einem MALS Detektor gemessen. Die resultierenden Daten sind in der folgenden Abbildung dargestellt, in der deutlich wird, dass die gleichen Molekulargewichte von beiden Detektoren erhalten werden. Dies bestätigt, dass ein RALS Detektor die gleichen Ergebnisse wie ein MALS Detektor für Proben bietet, die isotropes Streuen zeigen.

Protein-Molekulargewichte, berechnet mit RALS und MALS Detektoren; Molekulargewichte in kDa

Falls Sie nicht nur an Molekulargewicht, sondern auch an Molekülgröße interessiert sind, bietet ein MALS Detektor die Möglichkeit, den Radius der Gyration (Rg) einer Probe zu berechnen. Es gibt jedoch einen Haken: Dies ist nur für Proben mit einem Radius größer als 10-15 nm möglich, da Rg aus der Steigung berechnet wird, die durch die Winkeldependenz im partiellen Zimm Plot erzeugt wird. Wenn die Probe ein isotroper Streuer ist, gibt es keine Steigung und Rg kann nicht bestimmt werden. Als eine Randbemerkung kann der hydrodynamische Radius (Rh) von Proben bis zu einigen nm durch die Kombination der intrinsischen Viskosität (IV) Daten eines Viskosimeterdetektors mit den vom Lichtstreudetektor erhaltenen Molekulargewichtsdaten bestimmt werden.

Darüber hinaus gibt es möglicherweise einige praktische Punkte zu berücksichtigen, die spezifisch für Ihre Anwendung sind. Wenn Sie mehrere Detektoren integrieren, insbesondere für UPLC-Anwendungen, kann zum Beispiel die kleinere Flusszelle im RALS/LALS Detektor von Vorteil sein. Alternativ, wenn Sie zuvor unter einer Kontamination einer Lichtstreuzelle gelitten haben, könnten Sie feststellen, dass eine bestimmte Zellorientierung (wie die vertikale Flusszelle im SEC-MALS 20) zusätzliche Robustheit und Zuverlässigkeit bietet.

Natürlich ist die persönliche Präferenz immer ein Faktor bei der Entscheidung über einen Lichtstreudetektor. Vielleicht haben Sie immer einen MALS Detektor verwendet und fühlen sich wohler bei der Berechnung von Molekulargewichten mit einem spezifischen Extrapolationsmodell. Oder vielleicht bevorzugen Sie die Einfachheit und Direktheit des RALS/LALS Ansatzes für die Berechnung von Molekulargewichten. Oder vielleicht arbeiten Sie innerhalb eines Budgets und möchten den Wert Ihres Instruments maximieren.

Ich möchte zu diesem letzten Punkt kurz kommentieren, da es etwas ist, mit dem sich jeder identifizieren kann. Die Kosten dieser Detektoreinheiten skalieren je nach Anzahl der einzelnen Lichtstreudetektoren. In der RALS/LALS Konfiguration gibt es zwei Detektoren; im SEC-MALS 20 gibt es zwanzig. Die Preise variieren entsprechend. Es gibt keinen praktischen Nachteil, die Vielzahl an Winkeln in einem MALS Detektor zu haben, aber wie oben bezüglich isotroper Streuer erörtert, bieten die zusätzlichen Winkel nicht immer zusätzliche Informationen.

Und während es nicht der kosteneffizienteste Weg ist, können Sie sogar sowohl MALS als auch RALS/LALS Detektoren im selben System haben, die Daten gleichzeitig sammeln und dann entscheiden, welchen Sie für Berechnungen bei der Datenanalyse verwenden möchten.

Hoffentlich habe ich in diesem Beitrag genug Informationen bereitgestellt, um Ihnen zu helfen festzustellen, ob ein MALS oder RALS/LALS Detektor (oder beide!) am besten für Sie und Ihre Anwendung geeignet ist. Egal, wofür Sie sich entscheiden, wir haben Sie abgedeckt!

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