In diesem technischen Hinweis zeigen wir die herausragende Empfindlichkeit des Creoptix WAVE. Dank des erweiterten Sensorfelds, mit dem die Gitter-gekoppelte Interferometrie (GCI)-Technologie misst, ist eine hochauflösende kinetische Bestimmung auch bei sehr geringen Reaktionen möglich, was die Materialkosten erheblich senken kann.
Bei der markerfreien Analyse molekularer Wechselwirkungen stellt die Massentransportbegrenzung eine erhebliche Quelle für Abweichungen von der Kinetik erster Ordnung dar. Aufgrund von Analytkonzentrationsgradienten zwischen der Bulk-Lösung und der Oberfläche ist die Massentransportbegrenzung besonders bei den hochdichten Ligandenimmobilisierungsgraden ausgeprägt, die oft erforderlich sind, um ein messbares Bindungssignal zu erzeugen.
Durch den Einsatz der proprietären Gitter-gekoppelten Interferometrie (GCI)-Technologie bietet das Creoptix WAVE eine höhere Empfindlichkeit als herkömmliche Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Methoden, insbesondere bei geringen Ligandenimmobilisierungsgraden von wenig aktiven Proteinen. Dies führt selbst bei sehr geringfügigen Reaktionen (Rmax < 1) zu einer zuverlässigen Kinetik.
Durch die Charakterisierung der Wechselwirkung zwischen Acetazolamid und Carboanhydrase II unter Verwendung unterschiedlicher Immobilisierungsdichten des Enzyms zeigen wir, dass das Creoptix WAVE einen stark reduzierten Probenverbrauch ermöglicht und gleichzeitig eine Massentransportbegrenzung vermieden wird.
| CAII-Erfassungsgrad
(pg/mm2) | kon (M-1.s-1) | koff (s-1) | km | Rmax (pg/mm2) | KD (nM) | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Kinetische Daten MTL-Modell | 8100 | 1.29x106 | 0,0418 | 6.12x106 | 18,688 | 32,5 |
| Kinetische Daten 1:1-Modell | 1240 | 0.77x106 | 0,0324 | - | 0,469 | 42,3 |
Tabelle 1: Kinetische Daten für die Bindung von Acetazolamid an Carboanhydrase II (CAII) verschiedener Dichte
Legende: (A) Sensorgramme, die die Wechselwirkung zwischen Acetazolamid (Analyt, MW 222,25 Da) und Carboanhydrase II (CAII, Ligand, MW 29 kDa) bei niedriger und hoher Immobilisierungsdichte zeigen. CAII wurde auf einem 4PCH WAVEchip wie angegeben bei unterschiedlichen Immobilisierungsdichten erfasst. Die Dosiswirkungskurven für Acetazolamid wurden für die einzelnen Immobilisierungsgrade aufgezeichnet. Das Modell zur Massentransportbegrenzung (MTL) wurde zur Anpassung der Daten von dem hohen Immobilisierungsgrad (links) verwendet, da die Wechselwirkung vom 1:1-Modell (rechts) bei Verwendung der Creoptix WAVEcontrol Software abwich. (B) Die Daten zeigen, dass die kinetischen Anpassungen bei niedrigem Immobilisierungsgrad nicht auf den Massentransport beschränkt sind, sondern vielmehr der Kinetik erster Ordnung folgen.
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Abbildung 1: Bindung von Acetazolamid an Carboanhydrase II (CAII) verschiedener Dichte
