Una introducción básica a la dispersión de luz dinámica (DLS) para el análisis del tamaño de partículas – Preguntas y Respuestas

El valor del intercepto es la relación señal/fondo y el valor variará según la muestra y la configuración óptica del instrumento. Los valores apropiados están entre 10% y 100% (es decir, 0.1 a 1.0). Un valor menor del esperado puede indicar una concentración de muestra demasiado alta o baja, absorción o fluorescencia de la muestra. Una concentración de muestra demasiado alta puede llevar a efectos de dispersión múltiple que reducirán el valor del intercepto. La configuración NIBS del Zetasizer Nano S/ZS/ZSP permite minimizar la longitud de trayectoria del haz láser, lo que, a su vez, minimizará cualquier dispersión múltiple presente. Si hay una baja dispersión adicional, es decir, la diferencia en la dispersión entre el dispersante y las partículas dispersas en el dispersante, entonces el intercepto será bajo. La presencia de fluorescencia o absorción de la muestra también puede reducir el intercepto. En el caso de la fluorescencia, existe la opción de instalar un filtro de banda estrecha en el instrumento que eliminará cualquier luz fluorescente presente.

DLS mide las fluctuaciones dependientes del tiempo en la intensidad de la luz dispersada y, por lo tanto, la información fundamental obtenida de la técnica se basa en la intensidad de la luz dispersada. El diámetro promedio z es el diámetro medio ponderado por intensidad obtenido del análisis de cumulantes según se define en ISO22412 (2017) y la distribución de tamaño primaria se basa en la intensidad.

Aunque la transformación de la distribución de intensidad medida a volumen o número parece sencilla, se advierte fuertemente a los usuarios de DLS que tengan cuidado de no sobreanalizar los resultados. La técnica DLS tiende a sobrestimar el ancho de los picos en la distribución y este efecto se magnifica en las transformaciones a volumen y número. Las distribuciones de tamaño de volumen y número solo deben usarse para estimar las cantidades relativas de material en picos separados, ya que las medias y particularmente los anchos son menos fiables. Por lo tanto, se recomienda usar la distribución de tamaño por intensidad para informar el tamaño de cada modo en la distribución, pero usar los datos de volumen o número para informar las cantidades relativas de cada familia de partículas en la muestra.

La dispersión de luz dinámica mide las fluctuaciones dependientes del tiempo en la intensidad de la luz dispersada, lo que permite la determinación de los coeficientes de difusión de translación (es decir, movimiento browniano) y, por lo tanto, el tamaño de partículas/moléculas.

La dispersión de luz estática mide la intensidad promediada en el tiempo en la luz dispersada. En el rango de productos Zetasizer, la intensidad promediada en el tiempo de la luz dispersa se mide como una función de la concentración de la muestra (es decir, soluciones moleculares) y a partir de esto se determina el peso molecular absoluto de una solución macromolecular. En el rango de productos Mastersizer, la intensidad promediada en el tiempo de la luz dispersa se mide como una función del ángulo y esto permite la determinación del tamaño de las partículas.

La respuesta a esta pregunta es sí, puede. DLS asume que las partículas/moléculas que se están midiendo están experimentando un movimiento aleatorio, movimiento browniano. Esto es cierto en una concentración de muestra diluida. Sin embargo, a medida que la concentración de la muestra aumenta, pueden ocurrir otros efectos como dispersión múltiple, difusión restringida, interacciones partícula-partícula. Mientras que la influencia de la dispersión múltiple puede minimizarse utilizando la detección de retrodispersión y midiendo cerca de la pared de la cubeta, la difusión restringida y las interacciones partícula-partícula son más problemáticas de entender. Normalmente, la difusión restringida puede compensarse utilizando la viscosidad de la muestra, en lugar de la del dispersante. Las interacciones partícula-partícula son mucho más complejas y no pueden compensarse.

El tamaño obtenido de una medición de DLS debería ser independiente de la concentración de la muestra (ISO22412 (2017)). Sin embargo, cuando el tamaño obtenido para cualquier muestra depende de la concentración de la muestra, se debe realizar una serie de diluciones y se debe graficar el coeficiente de difusión medido de cada concentración de muestra como una función de la concentración y extrapolar los datos a concentración cero. El valor obtenido en concentración cero es el verdadero coeficiente de difusión (es decir, tamaño medio) de la muestra. Esto se conoce como un gráfico de Debye dinámico y se discute en ISO22412 (2017). Si tiene la clave de característica avanzada de proteínas instalada en su software Zetasizer, los calculadores contienen un gráfico de Debye dinámico.

He adjuntado algunos documentos que discuten los efectos de la concentración con más detalle.
Aplicación de la dispersión de luz dinámica (DLS) a formulaciones terapéuticas de proteínas: Principios, mediciones y análisis – 2. Efectos de concentración e interacciones de partículas
FAQ – ¿Qué es la dispersión múltiple?
FAQ – ¿Qué es la difusión restringida?

El límite inferior de tamaño en la dispersión de luz dinámica depende de muchos factores, como la configuración óptica del instrumento, la longitud/potencia de onda láser, la sensibilidad del detector, la concentración de la muestra y el nivel adicional de dispersión. Este último punto es la diferencia en la dispersión entre el dispersante utilizado y las moléculas/partículas en el dispersante. Cuanto mayor sea el nivel de dispersión adicional, más fácil será medirlo. El tamaño más pequeño que hemos medido en un Zetasizer es de 0.6nm (modo pico) y he adjuntado una nota de aplicación que da detalles de tales mediciones.

Nota de aplicación “Midiendo tamaños subnanométricos usando dispersión de luz dinámica“

Esto usualmente significa que su muestra contiene partículas muy grandes/agregados/polvo, lo que causa una interferencia con las mediciones. Nos referimos a esto como fluctuaciones de número y he adjuntado un FAQ que discute esto en más detalle. Lo que es seguro es que la muestra no es adecuada para DLS y que el material grande debe ser eliminado antes de realizar las mediciones.

FAQ – ¿Qué son las fluctuaciones de número?