Principios Básicos del Análisis de Seguimiento de Nanopartículas – Preguntas y Respuestas

NTA produce una distribución ponderada por número porque es un análisis partícula por partícula. DLS naturalmente produce una distribución ponderada por intensidad, que puede convertirse en ponderada por volumen y luego en ponderada por número. En las guías ASTM, se indica específicamente que la distribución basada en número derivada de DLS está sujeta a grandes inexactitudes y no se recomienda para el uso rutinario. NTA por naturaleza es una técnica basada en números, por lo que la misma muestra en estas dos técnicas puede mostrar resultados algo diferentes.

Consulte nuestra nota técnica sobre Comparación de Medidas Estadísticas Reportadas por las Técnicas NTA y DLS.

También tenemos un documento técnico comparando resultados de NTA y DLS en una variedad de tipos de muestras. Esto debería dar una mejor idea de cómo encajan ambas técnicas.

NTA no ajusta los datos a ninguna forma de pico en particular, no ajusta las distribuciones de tamaño después del análisis, ni sesga partes diferentes del rango de tamaño. Los histogramas solo son una visualización de todas las partículas individuales después de que se ha analizado su tamaño. Dado que nuestros datos básicos son una población de partículas individuales, cualquier medida estadística son estadísticas de población directas en lugar de interpolaciones de una distribución derivada.

La dilución probablemente será necesaria a menos que tenga una muestra que sea muy dispersa desde el principio. Si está familiarizado con las mediciones DLS, generalmente estamos de 10 a 1000 veces más diluidos que eso. Idealmente en el rango de 10^7 a 10^9 partículas/ml.

Las emulsiones en el rango de tamaño submicrónico son ciertamente adecuadas para esta técnica. Siempre que las muestras se diluyan con un líquido adecuado que mantenga la estabilidad de las gotas, la medición debería ser bastante fácil.

Los monómeros de proteína están muy por debajo del límite inferior de detección de esta técnica, pero monitorear la agregación de proteínas es una aplicación fuerte para estos instrumentos debido a su capacidad con distribuciones polidispersas y para proporcionar una concentración de los agregados que se miden. Nuestra nota de aplicación sobre agregación de proteínas debería proporcionar un poco más de información.

La naturaleza de la medición produce el diámetro hidrodinámico, lo que significa el tamaño del objeto que se mueve en el líquido. Cuando se añade algo de tamaño significativo a la superficie de la partícula primaria, afecta el movimiento de la partícula en el líquido, por lo tanto, el tamaño reportado. Agregar surfactantes o anticuerpos a la superficie de la partícula debería ser suficiente para mostrar un cambio en el tamaño reportado equivalente al tamaño de las moléculas unidas. Se han visto cambios de tamaño tan pequeños como tres nanómetros de manera confiable en algunos experimentos de recubrimientos/sin recubrimiento.

DLS y NTA/NanoSight responderán de la misma manera ya que el movimiento browniano en el que ambas técnicas se basan se verá afectado de igual manera. NTA podría ser ligeramente más fiable en mostrar ese cambio ya que puede medir las partículas primarias de manera precisa, independientemente de lo que más pueda haber en la muestra.

Otra técnica para considerar en esta aplicación es la Medición de Masa por Resonancia (RMM), como se refleja en el producto Archimedes de Malvern. Si las partículas primarias están dentro del rango de medición de la técnica, la sensibilidad de la técnica permite medir fácilmente el cambio debido al recubrimiento.

La ecuación de Stokes-Einstein requiere variables de temperatura y viscosidad para ser ingresadas. Para cualquier diluyente a base de agua, la viscosidad puede ser leída automáticamente a partir de la tabla de valores dependientes de la temperatura. La temperatura se mide en la celda de la muestra y se lee automáticamente en el software para la mayoría de los modelos NanoSight. Por lo tanto, a menos que el diluyente sea significativamente diferente del agua, el usuario no necesitará ingresar manualmente ningún valor.

Comparar dos técnicas diferentes podría tomar muchas páginas, pero resumiré las principales diferencias. Más importante aún, debe considerar qué está tratando de aprender sobre su muestra y qué técnica podría ser la más sensible para eso.

NTA y TRPS a menudo se consideran juntos porque tienen rangos de medición y parámetros similares. NTA tiene un límite inferior de detección, por lo que es capaz de ver la distribución completa de tamaños para muestras que se extienden muy por debajo de los 100nm. NTA no requiere una solución electrolítica fuerte, lo que podría interferir con la estabilidad de algunas muestras. Las muestras pueden medirse en cualquier diluyente a base de agua o en una amplia gama de disolventes orgánicos. El poro sensor de TRPS debe ser calibrado frecuentemente para obtener resultados precisos y es susceptible a obstruirse. Debido a que cada partícula se extrae una a la vez, tiene el potencial de ser una técnica de mayor resolución. NTA es generalmente más flexible, tiene un rango de aplicación más amplio, es mucho más rápido y más reproducible para usar en la práctica, tiene la capacidad de trabajar en modo de fluorescencia, y es más ampliamente aceptado en la comunidad científica debido a estas mayores capacidades.

Si está considerando estas técnicas, daremos la bienvenida a la oportunidad de probar algunas muestras para mostrar de qué es capaz el sistema. Todas las técnicas tienen fortalezas y debilidades, como se evidencia por el rango de técnicas en el portafolio de Malvern.

Tal vez sea una cuestión semántica, pero NTA no es una técnica que requiera calibración per se. Los estándares deben ejecutarse rutinariamente para verificar el correcto funcionamiento y para verificar el desplazamiento a largo plazo. Si esos resultados están fuera de las especificaciones o muestran desplazamiento, contacte al equipo de soporte de Malvern. Acceda al procedimiento detallado para los estándares de látex de poliestireno más comúnmente usados para obtener más información.

Sí, el modelo NanoSight NS500 tiene la capacidad de medir el potencial zeta en base a partícula por partícula. Nuestra nota técnica proporciona algunos detalles sobre el proceso. Si desea caracterizar componentes individuales en un material mezclado o si el potencial zeta es una manera de caracterizar un cambio en la muestra, esto puede ser una alternativa valiosa a la dispersión de luz electroforética tradicional del potencial zeta como se usa en los modelos Zetasizer de Malvern.

La respuesta simple es cualquier configuración que permita que las partículas permanezcan en el campo de visión durante 5-10 segundos. Esto depende de qué modelo de instrumento y placa superior se esté usando. Más detalles y rangos de velocidades recomendadas se encuentran en nuestra nota técnica sobre análisis en modo de flujo.

He trabajado con varias muestras de arcilla y medioambientales. Para la mayoría de muestras de agua ambientales, a menudo se miden como se reciben, generalmente con cierto nivel de dilución. Si comienzas con cualquier tipo de polvo seco, generalmente se requerirá algún esfuerzo para dispersarlas en un líquido para llegar a las partículas primarias (no aglomerados). Se requeriría algún surfactante (p. ej., polifosfato de sodio) y energía mecánica como la sonicación. Dependiendo de tu objetivo (medir aglomerados o partículas primarias), determinará qué estrategia seguir y cuánta energía quieres impartir.

La cámara de muestra NanoSight está cerrada, por lo que la evaporación/precipitación tendría que hacerse externamente, luego inyectarse en la celda de muestra. Las mediciones pueden ser tan rápidas como unos pocos segundos si solo necesitas una estimación rápida del tamaño. Desde un recipiente de reacción a la cámara de medición es solo cuestión de cargar una jeringa e insertarla en el instrumento, por lo que puede ser una respuesta rápida.

NTA no puede ver la forma de la partícula. Todas las partículas aparecerán como un punto de luz y el sistema solo analiza el movimiento de ese punto de luz. Una partícula de alto aspecto de relación podría generar un punto de luz que no sea perfectamente redondo, pero también gira y fluctúa, por lo que no hay información consistente con la que trabajar. La salida es un diámetro equivalente esférico, es decir, una esfera que tiene un volumen equivalente al de la partícula medida. Si se miden dos muestras de varillas de diferentes longitudes, el diámetro esférico equivalente mostraría una diferencia relativa a la diferencia en volumen de la partícula.

Esferas y varillas pueden medirse juntas en una muestra, pero la única forma de distinguirlas sería si los dos diámetros esféricos equivalentes son lo suficientemente diferentes entre sí.

Para cambiar la viscosidad, abre los archivos que deseas cambiar. Deberían aparecer resaltados en azul como se muestra a continuación. Haz clic en Cambiar Configuración>Viscosidad, desmarca la casilla, luego haz doble clic donde dice AGUA en la imagen ahora. A continuación, puedes ingresar la viscosidad en cP. Haz clic en Actualizar y debería volver a procesar y mostrar los datos ajustados. Necesitarás Exportar Resultados si deseas hojas de cálculo o informes PDF actualizados.

De los archivos de hojas de resumen que exportamos, solo inserta>grafica>gráfico de líneas, luego selecciona la columna ‘concentración’ como los datos reales. El centro del bin será las etiquetas del eje x.

El umbral de detección correcto dependerá del tipo de muestra y de cómo se recopiló el video. Si ajustas el nivel de la cámara para que todas las partículas sean visibles, pero las partículas más grandes no estén saturadas (si ese compromiso es posible), usualmente resulta en que los análisis se ejecuten con el umbral de detección predeterminado de 5.

La lógica es hacer el umbral lo suficientemente bajo como para que todas las partículas estén marcadas con la cruz roja, pero no tan bajo que estés marcando ruido óptico y efectos de fondo. La imagen siguiente es del manual e ilustra estos dos aspectos del problema.

Para tener una buena idea del efecto de cambiar el umbral de detección, toma un video y analízalo una y otra vez con diferentes umbrales de detección. Hasta que llegues obviamente a un punto en que en una dirección, los resultados no cambian en gran medida con pequeñas diferencias en la configuración. Poder observar las partículas mientras se rastrean en una pantalla debería hace claro cuando estamos perdiendo partículas o recogiendo ruido.

No tenemos un procedimiento documentado, pero recomiendo este artículo del blog.

DLS puede medir la mayoría de materiales hasta tamaños por debajo de 1 nm, pero NTA también es muy capaz en el rango de <80 nm. Dependiendo del índice de refracción del material, el límite inferior podría ser ~10 nm para metales, alrededor de 30 nm para polímeros, y ~40 nm para liposomas. Siempre que seamos capaces de ver las partículas, entonces el análisis de esa imagen para la determinación del tamaño es fácil y robusto.

NTA no podrá ver partículas dentro de otro objeto. La dispersión de luz necesaria para ver las nanopartículas se dispersará desde la superficie de la célula y eso será lo único captado por la cámara. Se requerirá una técnica microscópica directa para ver partículas internalizadas.