Configuración del conjunto de columnas GPC/SEC más adecuado para la muestra

Si alguna vez ha trabajado con GPC/SEC (por ejemplo, OMNISEC), sabrá que todos los análisis dependen de la configuración del conjunto de columnas. Y seleccionar las columnas adecuadas para su aplicación a veces puede ser complicado. En ocasiones, puede ser necesario un conjunto de columnas completamente nuevo para diferentes tipos de muestras.

Hay varios factores a considerar al elegir el conjunto de columnas más adecuado a la muestra. Debe considerar el rango de tamaño/peso molecular, la compatibilidad entre la fase móvil utilizada para disolver la muestra y las columnas, y la compatibilidad entre los grupos funcionales en la muestra y la fase estacionaria de las columnas. Si utiliza varias columnas, deberá considerar si se complementan entre sí y en qué orden deben conectarse.

En esta publicación, proporcionaremos información general sobre las columnas y ofreceremos ideas sobre cómo crear un conjunto de columnas adecuado para sus muestras. La información aquí se centra principalmente en seleccionar el mejor conjunto de columnas desde la perspectiva del rango de tamaño/peso molecular. Consulte esta publicación enlazada y webinars para obtener información sobre las columnas disponibles para diversos análisis con fases móviles.

¿Qué ocurre en el conjunto de columnas?

Comencemos con un resumen breve de cómo funciona la separación dentro de un conjunto de columnas GPC/SEC. Como se puede ver en la imagen arriba, una mezcla disuelta de dos muestras de diferente tamaño se introduce en la columna. Con el tiempo, las dos fracciones de la muestra y el disolvente se desplazan a través de la columna a diferentes velocidades. La muestra de mayor tamaño se eluye primero (Población 2), seguida por la de tamaño más pequeño (Población 1), mientras que el disolvente eluye al final.

¡Es importante entender que la separación se basa en el tamaño molecular, no en el peso molecular del analito!

Estas separaciones ocurren porque la fase estacionaria de las columnas está compuesta de partículas de gel poroso. Estos poros son lo suficientemente grandes para que las moléculas de la muestra se difundan dentro de ellos al pasar por la columna. Las moléculas pequeñas se difunden más fácilmente en los poros, por lo que pasan más tiempo dentro de ellos que las moléculas de tamaño mediano y grande. Las moléculas más grandes no se difunden fácilmente, por lo que su trayecto a través de la columna es más simple y rápido.

Con GPC/SEC, la separación se realiza en función del tamaño molecular, siendo las moléculas grandes las primeras en eluir, seguidas por las de tamaño mediano y finalmente por las pequeñas. Por favor, consulte la descripción de la animación a continuación. El gran triángulo se eluye primero sin desparramar mucho tiempo difundiéndose en los poros, seguido por el cuadrado mediano, y por último, el pequeño círculo que se desplaza fácilmente dentro de los poros.

Columnas de cama mixta y de tamaño de poro único

Las diferencias entre estos dos tipos de columnas se explican con más detalle en esta publicación. En resumen, las columnas de cama mixta contienen una fase estacionaria de gel con partículas y tamaños de poro mixtos, proporcionando una capacidad resolutiva a lo largo de un amplio rango de tamaño/peso molecular. Las columnas de tamaño de poro único incluyen un gel de fase estacionaria homogéneo que ofrece una capacidad resolutiva excelente a lo largo de un rango de tamaño/peso molecular relativamente limitado.

Cómo combinar columnas para crear un conjunto de columnas

Para crear un conjunto de columnas optimizado para su muestra, probablemente necesitará combinar dos o más columnas. (Sin embargo, si una columna es suficiente para proveer la resolución necesaria para su muestra, no será necesario combinarlas.) Esto ahorrará tiempo y solventes móviles. Esto es común en el caso de las muestras de proteínas, cuyos pesos moleculares cubren un amplio rango, pero cuyos tamaños están más restringidos que el rango de tamaños de los polímeros debido a su estructura plegada.

Hay tres enfoques generales que puede tomar al combinar columnas para crear un conjunto. Cabe destacar que estas son sugerencias y no metodologías exhaustivas.

2 columnas de cama mixta: Este es el conjunto de columnas más universalmente usado, incluyendo columnas orgánicas, acuosas y especializadas. Para aclarar, usaremos dos columnas de cama mixta iguales. Por ejemplo, al analizar un lote de polisacáridos, comúnmente utilizamos dos columnas A6000M de cama mixta para análisis acuosos. Con dos columnas de cama mixta, tiende a maximizar el rango de tamaño/peso molecular mientras mantiene el tiempo de ejecución por debajo de los 45 minutos aproximadamente.

Columna de alto/bajo MW combinada con columna de cama mixta: Para muestras que contienen especies con tamaños/pesos moleculares excepcionalmente altos o bajos, como agregados u oligómeros, preferimos agregar una columna de tamaño de poro único de alto/bajo MW a una sola columna de cama mixta. La columna de tamaño de poro único de alto/bajo MW asegura una suficiente capacidad resolutiva en las características específicas de las muestras dentro de los extremos del continuo de tamaño molecular, mientras que la columna de cama mixta cubre el resto del material de la muestra. Para mejorar la resolución entre los picos de la muestra y el solvente, se puede añadir una columna de bajo peso molecular a la columna de cama mixta.

Combinar varias columnas de tamaño de poro único: Esta estrategia es útil si ya se sabe que no se necesita la capacidad de resolutiva en el rango completo de tamaño/peso molecular que proporciona una columna de cama mixta. Este tipo de conjunto de columnas puede ser ventajoso en entornos de monitoreo de muestras similares, como en QC. La ventaja es obtener máxima resolución en los tamaños/pesos moleculares asociados con la muestra. Puede combinar más de dos columnas de tamaño de poro único, como T5000 + T3000 + T1000, para abarcar un amplio rango de tamaño/peso molecular. En este ejemplo, aunque se extiende el tiempo de análisis, también se mejora la resolución.

Al combinar columnas de tamaño de poro único, es importante asegurarse de que no haya una brecha más allá de una columna entre ellas. Esto evitará que surjan diferencias en el rango de resolución. Volviendo al ejemplo de utilizar tres columnas de tamaño de poro único, simplemente combinar T5000 + T1000 no es recomendable. Esto puede generar un perfil de elución como el mostrado a continuación, donde se observarían formas de picos y artefactos extraños en los datos, que son un resultado del cromatograma y no de la muestra.

El orden de las columnas

Mucha gente se pregunta ‘¿en qué orden deberían estar conectadas las columnas al combinarlas?’

La disposición que recomendamos es empezar con la columna de mayor tamaño/peso molecular y descender hacia la de menor tamaño/peso. Esto permite que las moléculas más grandes comiencen a separarse tan pronto como toda la mezcla de muestra se introduce inicialmente en el conjunto de columnas. Si las columnas se ordenaran en sentido inverso, las moléculas más grandes serían forzadas a través de columnas de menor tamaño/peso, potencialmente impidiendo que las moléculas más pequeñas se difundan en los poros.

Por esta razón, en el ejemplo usamos las columnas T5000 + T3000 + T1000. Al combinar columnas de tamaño de poro único con columnas de cama mixta, se añade una columna de tamaño de poro único de alto tamaño/peso molecular antes de la columna de cama mixta y una columna de tamaño de poro único de bajo tamaño/peso después de la misma.