N-valor datos ITC

No deseches tus datos «malos» de N-valor ITC

El N-valor, comúnmente referido como la estequiometría, a menudo se usa como un calificativo para una titración «buena» o «mala». El razonamiento es el siguiente: «si mi N-valor es 20% o más diferente de la estequiometría esperada (a menudo 1), entonces los resultados de mi titración son inválidos». En realidad, esto no siempre es el caso. Es importante entender que el N-valor de ITC no es lo mismo que la estequiometría (proporción de enlace). El N-valor de hecho es igual a la estequiometría si las concentraciones que usamos para el ajuste son correctas y 100% activas. Una forma de expresar el N-valor es la siguiente:

Cualquiera de los tres valores en esta ecuación puede cambiar N, lo que significa que N es una medida de la proporción de enlace tanto como de la actividad de las muestras. Dos de estos valores deben ser conocidos (o asumidos) para obtener el tercero. Por ejemplo, si uno está interesado en la estequiometría, entonces las concentraciones proporcionadas en el ajuste deben ser precisas y 100% activas. Si uno está interesado en la actividad de la muestra en la celda (a menudo proteína), entonces deben asumirse la estequiometría y la concentración activa de la muestra en la jeringa (ligando).

Considere FIG.1:

Las concentraciones proporcionadas son 20uM de proteína (en la celda) y 200uM de ligando (en la jeringa), N=0.86. Probablemente una de estas dos (o ambas) concentraciones no es precisa, la probabilidad de la proporción de enlace es 1:1 (N=1) o 1:2 (N=0.5, 2 proteínas: 1 ligando). Si asumimos que es 1:1 y que el ligando 200uM es correcto, entonces ajustar los datos con 17uM de proteína llevará el N a 1, lo que significa que la concentración real de proteína competente para el enlace es 17uM. En el nuevo software PEAQ Data Analysis, cualquiera de los 3 desconocidos (N, [proteína], [ligando]) puede asignarse como variable.

El N-valor puede visualizarse fácilmente como el valor del eje X en el punto medio (inflection) de una curva sigmoidea ITC. Hay ciertas titraciones que no tienen un punto de inflexión claro – son o bien con 1) bajo valor C (curva plana) o 2) alcanzan saturación «demasiado pronto», ya sea porque la concentración activa en la celda es demasiado baja o la concentración de ligando es demasiado alta.

1)      En el caso de bajo valor C, el problema es la baja afinidad y las bajas concentraciones resultando en una curva plana. Considere FIG.2:

Kd está en el rango medio a alto uM pero la concentración de proteína es solo 50uM, lo que resulta en una curva plana. Para convertirla en una sigmoidea con bien definido punto medio, necesitamos tener concentraciones de proteína de 10x (o más) por encima del Kd. A menudo, esto no es una opción, así que los investigadores recurren a la llamada titración de bajo valor C – en este caso, la concentración de proteína se mantiene baja pero la concentración de ligando se incrementa para que la curva alcance cierto grado de saturación (nótese la alta proporción molar). Tal curva carece de punto de inflexión, así que el valor N es desconocido y debe asumirse y fijarse en un valor constante durante el ajuste.

2)      En el caso de saturación «temprana» – el problema es las concentraciones inexactas. El valor N aparece muy pequeño. Por ejemplo en FIG.3:

Si dejamos que N varíe durante el ajuste, obtendremos un valor de 0.0008, que ciertamente no es la estequiometría real, además el dH es inusualmente alto (dH para interacciones biológicas raramente excede 30 kcal/mol).

¿Cómo extraer datos Kd y dH confiables de tales titraciones? Realizando ajustes con un par de valores extremos supuestos de N y registrando la variación de Kd y dH. Por ejemplo, podemos asumir que la estequiometría para FIG.2 está en algún lugar entre 0.1 y 5 basado en la calidad razonable de los ajustes que obtenemos con estos dos escenarios extremos. En este caso, el Kd varía muy poco – de 980uM a 588uM respectivamente. De manera similar para fig3, el Kd varía de 25uM a 37uM para N de 0.2 a cercano a 0.

Aunque las curvas no sigmoideas son más desafiantes de analizar, no deben descartarse como resultados inadecuados. Los valores de Kd pueden no ser conocidos con absoluta certeza, pero generalmente convergen a valores dentro de un rango relativamente estrecho, incluso cuando la incertidumbre del valor N (y por extensión las concentraciones activas) es grande.

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