El papel de la medición diferencial de fluorescencia (DSF) y la calorimetría diferencial de barrido (DSC) en la evaluación de la estabilidad proteica

La evaluación de la estabilidad de las proteínas es un parámetro extremadamente importante en la investigación de productos biofarmacéuticos. En los últimos años, la medición diferencial de fluorescencia (DSF) se ha utilizado ampliamente como un método para evaluar las propiedades de desnaturalización de las proteínas. Debido a que DSF es relativamente simple y permite una detección rápida con una pequeña cantidad de muestra, es útil en estudios en las etapas iniciales de la investigación.

Sin embargo, en el campo del desarrollo farmacéutico, con la aparición de modalidades diversas como complejos anticuerpo-fármaco, anticuerpos biespecíficos, ácidos nucleicos y nanopartículas lipídicas de ARNm (LNP), la necesidad de métodos de medición más versátiles está creciendo. En este contexto, también se observan casos en los que el alcance de aplicación de DSF es limitado.

Por otro lado, la calorimetría diferencial de barrido (DSC) es un método de alta versatilidad que se utiliza no solo para medir la estabilidad térmica de las proteínas, sino que también tiene una amplia gama de aplicaciones. Además, al medir la estabilidad térmica de las proteínas, DSC puede proporcionar una vista general más completa que DSF, lo que puede mejorar la toma de decisiones y reducir la posibilidad de falsos positivos.

¿Qué es la medición diferencial de fluorescencia (DSF)? Sus características y consideraciones

DSF es un método que utiliza colorantes fluorescentes para capturar cambios en la fluorescencia asociados con la desnaturalización de proteínas. A medida que la temperatura aumenta, el colorante fluorescente interactúa con las regiones hidrofóbicas de la proteína, detectando el progreso de la desnaturalización. Este método es rápido y tiene la ventaja de poder realizarse con una pequeña cantidad de muestra.

Sin embargo, dado que depende de los colorantes fluorescentes, la fiabilidad de los resultados puede disminuir en muestras que no interactúan con el colorante o que son sensibles a la influencia de compuestos coexistentes. Además, DSF se limita principalmente a medir T_m (temperatura de desnaturalización) y no proporciona otra información termodinámica como entalpía o capacidad calorífica.

DSC para un análisis más completo

La calorimetría diferencial de barrido (DSC) es un método que no requiere colorantes fluorescentes y mide directamente la absorción y liberación de calor asociadas con la desnaturalización de las proteínas. Además de T_m, DSC proporciona un perfil termodinámico detallado que incluye cambios en la entalpía (ΔH) y capacidad calorífica (C_p), lo cual ofrece un análisis más profundo.

Además, DSC no se ve afectado por artefactos ópticos y puede aplicarse a varios tipos de biomoléculas (proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, etc.), lo que lo hace notablemente reproducible y versátil como método de medición.

Comparación y aplicación de DSF y DSC en la medición de la estabilidad de proteínas

DSF es muy útil en las etapas iniciales de la detección, donde se priorizan la rapidez y eficiencia debido a su capacidad de detección de alto rendimiento y al pequeño volumen de muestra requerido. Gracias a su simplicidad, se utiliza ampliamente como soporte para la toma de decisiones en las etapas iniciales de la investigación.

Sin embargo, debido a que la medición se basa en señales fluorescentes, puede haber variaciones en la señal debido a la interacción con compuestos coexistentes o el colorante, lo que hace que sea difícil de aplicar en ciertas condiciones de muestra.

Por otro lado, DSC proporciona datos termodinámicos más completos y reproducibles, lo que lo hace especialmente eficaz en escenarios donde se requiere una evaluación precisa, como el desarrollo de formulaciones biofarmacéuticas, la evaluación de biosimilares y la preparación de documentos para presentar a las autoridades reguladoras. DSC es menos susceptible a artefactos ópticos y mantiene alta fiabilidad incluso bajo diversas condiciones de tampones y cosolventes, lo que lo hace seguro de usar para la evaluación de calidad en etapas posteriores.

DSF y DSC tienen sus respectivas fortalezas, y es importante diferenciarlos según el propósito de la investigación. Por ejemplo, DSF es adecuado para la detección inicial y la evaluación rápida de múltiples muestras. En cambio, para el desarrollo de formulaciones, evaluación de biosimilares, y cuando se requiere una evaluación de estabilidad más detallada y precisa, DSC es una excelente opción.

En el desarrollo de biofarmacéuticos, la evaluación de estabilidad es un proceso crucial que impacta el diseño de la formulación, la gestión de calidad y la aprobación regulatoria. Equipos DSC de alta precisión como MicroCal PEAQ-DSC proporcionan datos termodinámicos confiables y son herramientas extremadamente útiles para los investigadores. Elegir el método adecuado de evaluación según la etapa y el propósito de la investigación contribuye en gran medida al éxito del desarrollo del producto.

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