Extracción de artículos de libros: Evaluación calórica de interacciones intermoleculares utilizando un calorímetro de titulación isotérmica (ITC)

Medicina Experimental Suplemento Especial «Análisis de interacciones para la investigación farmacéutica perfecta» (Editorial especializada en ciencias biológicas y medicina Editorial Yodosha publicada) Capítulo 1 Estándar de análisis de interacciones en el desarrollo farmacéutico – I Desarrollo farmacéutico de bajo peso molecular – 5 (Autor: Nagamune Akira, Tsumoto Kohei) en el que presentamos un artículo relacionado con ITC. Este artículo ha sido publicado con el permiso de Editorial Yodosha.

Evaluación calórica de interacciones intermoleculares utilizando un calorímetro de titulación isotérmica (ITC)

Nagamune Akira, Tsumoto Kohei

Objetivo y puntos clave del experimento

Un calorímetro de titulación isotérmica (ITC) es un dispositivo que detecta cambios térmicos en interacciones intermoleculares. Debido a que esto permite conocer directamente la calidad termodinámica no covalente de la unión de interacciones intermoleculares a partir de cambios térmicos, es posible obtener información sobre el modo de unión y especificidad de compuestos seleccionados durante el cribado, por ejemplo. Además, en la optimización estructural, es posible realizar análisis precisos a partir de parámetros termodinámicos para verificar si las interacciones ocurren según la estrategia de diseño. Combinando información estructural, se puede examinar directrices de diseño y vincular con la siguiente estrategia de diseño.

Introducción

La unión de pequeñas moléculas a proteínas en el desarrollo de medicamentos de moléculas pequeñas es clave debido a su modo específico de interacción. Por lo tanto, obtener información específica en cada paso de exploración, validación y optimización es crucial. La formación de enlaces no covalentes entre moléculas, la estructura tridimensional de proteínas o cambios de conformación, y cambios de estado de hidratación debido a encontrarse en solución acuosa, son todos factores de reacción exotérmica y endotérmica. Por lo tanto, en el análisis de interacciones de moléculas objetivo, la medición térmica ofrece un valioso indicador. Un calorímetro de titulación isotérmica (ITC: isothermal titration calorimeter) es el único método de análisis que puede observar cambios térmicos deseados en interacciones, permitiendo análisis termodinámicos de alta precisión. Para una información básica sobre el uso de ITC, consulte el Capítulo 1-13.

Optimización: Se confirma un hit al poder prever especificidad frente a proteínas objetivo gracias a la validación. Desde este compuesto hit, extendiendo su esqueleto y mejorando/agregando grupos funcionales, se puede mejorar la afinidad de unión y actividad funcional. A estos desarrollos estructurales se les llama optimización.

Durante la optimización de moléculas pequeñas, presentamos un ejemplo importante de estudio retrospectivo sobre la utilidad de conocimientos termodinámicos. Los parámetros termodinámicos de la proteína objetivo del inhibidor de la proteasa del VIH, un fármaco antirretroviral, se resumen en Figura 1A^{1, 2}). La figura muestra la disposición de inhibidores desarrollados entre 1996 (IDV) y los siguientes 10 años en orden de aprobación. Generalmente, a medida que se aprueban nuevos inhibidores, la afinidad de unión con la proteína objetivo mejora (ΔG se vuelve más negativo). Cabe destacar su perfil termodinámico (Figura 1B).

Los medicamentos iniciales (como IDV) eran del tipo impulsado por entropía, con entalpía de unión (ΔH) desfavorable y entropía de unión (ΔS) favorable. Sin embargo, a medida que los medicamentos se optimizan, el equilibrio de los parámetros termodinámicos cambia de un tipo impulsado por entropía a un tipo impulsado por entalpía (Figura 1B). En los inhibidores iniciales hay una mayor contribución de la entropía, mientras que en los nuevos inhibidores aprobados predominan las contribuciones de la entalpía. Además, puede observarse que estos inhibidores muestran una correlación de compensación ΔH−ΔS. Tendencias similares se han observado en otros medicamentos, como las estatinas para el tratamiento de la hipercolesterolemia y los bisfosfonatos para la osteoporosis^{3, 4}). Estos resultados sugieren que una alta especificidad con la proteína objetivo, es decir, la contribución de entropía y entalpía al impulso, son factores importantes en la optimización del medicamento. Entendiendo la contribución termodinámica de los grupos funcionales en la optimización y mejora estructural, se accede a un valioso conocimiento que ayuda a comprender la calidad de los medicamentos dirigidos a moléculas específicas. Deducir la generalidad de qué grupo funcional contribuye a la entalpía y cuál a la entropía no es fácil. Sin embargo, verificar los parámetros termodinámicos y diseñar racionalmente el medicamento son piezas clave para crear especificidad en el diseño de moléculas pequeñas para las proteínas objetivo.

Preparación

Consulte el Capítulo 1-13 para métodos básicos de preparación. Al usar compuestos, dado que es común incluir DMSO, se debe tener extremo cuidado para evitar variaciones de concentración.

Protocolo

El procedimiento básico del experimento y la operación se pueden encontrar en el capítulo 1-13. Básicamente, se recomienda colocar proteínas en el lado de la celda y compuestos en el lado de la jeringa.

Respuesta ante problemas

Preste atención a los cambios térmicos debido al DMSO
Cuando se usan compuestos, tienen frecuentemente un sistema de ensayo que contiene DMSO, lo que implica que grandes calores de reacción imprevistos o calores de dilución pueden observarse. Al igual que en SPR, DMSO en ITC también tiene un impacto en el calor de reacción relacionado con las interacciones. La preparación de muestras tanto en el lado de la celda como en el lado de la jeringa se debe realizar separadamente y con extrema precaución para que la concentración de DMSO no varíe. Una ligera diferencia en la concentración de DMSO puede ser observada como calor de dilución, ocultando el calor de interacciones de interés. Es crucial medir siempre el calor de dilución solo del compuesto, y preparar las muestras para minimizar los cambios térmicos derivados de DMSO.

Ejemplo de Experimento 1: Exploración mediante ensayo competitivo utilizando ITC⁵⁾

Para descubrir compuestos de pequeñas moléculas que se unan específicamente a proteínas objetivo farmacéuticas, explorar el espacio químico extensivo de la superficie proteica es un método de cribado eficiente y efectivo. Aquí surge una estrategia de descubrimiento de fármacos basada en una biblioteca de fragmentos con un peso molecular promedio menor que el de las librerías de compuestos convencionales, menos de 300 Da. Sin embargo, debido a la estructura química relativamente simple de los fragmentos, tienen baja afinidad de unión y constantes de disociación que a menudo alcanzan el rango de mM. En estos casos, ITC, que permite un enfoque de análisis físico-químico de alta sensibilidad, se posiciona como método de evaluación efectivo. Como en los ejemplos de inhibidores de proteasa del VIH mencionados anteriormente, se observa, en interacciones específicas de unión, una reacción exotérmica significativa y convergencia de la reacción. Un perfil similar indica formación de enlaces de hidrógeno. En cambio, en interacciones inespecíficas, no hay convergencia del calor de reacción y en reacciones hidrofóbicas, se observa endotermia. Debido a estas razones, es óptimo seleccionar los compuestos que muestran reacción exotérmica dentro de los grupos de compuestos hit, como potenciales candidatos. Cuando se han identificado completamente los sitios de unión en proteínas objetivo, y se conocen sustratos o ligandos de moléculas pequeñas que se unen a estos sitios, los ensayos competitivos son una estrategia efectiva. Realizar ensayos competitivos usando ITC permite seleccionar compuestos hit de unión específica al sitio, mostrando reacción exotérmica (Figura 2). A continuación, se explica un ejemplo práctico realizado por los autores.

1. Proteína Objetivo

Se dirigió hacia la isomerasa de cetosteroide (KSI) y 3-oxo-Δ5 isomerasa de cetosteroide (isomerasa que cataliza la conversión de 3-oxo-Δ5 cetosteroide en un isómero conjugado con actividad hormonal).

2. Exploración de Moléculas Pequeñas

Se seleccionaron compuestos desde una librería de fragmentos usando cribado SPR para KSI.

3. Ensayo Competitivo ITC (SITE)

Para los compuestos candidatos obtenidos en el cribado, se realizó validación efectiva de hits usando ensayo competitivo ITC. Esta técnica de análisis implica la coexistencia de la proteína objetivo y el compuesto obtenido del cribado, añadiendo un ligando conocido a dicho sistema de solución (Figura 2A), que desplaza al compuesto fragmento en el sitio de unión deseado. Si existe interacción en este sitio de unión del compuesto fragmentario con KSI, añadiendo un ligando conocido con mayor afinidad (deoxycholate: DOC), se estabiliza desplazando al fragmento. Cuando el fragmento realiza interacción con reacción exotérmica, la disociación derivada de la unión de DOC se muestra como una reacción endotérmica.

Para incrementar el volumen de tratamiento, se desarrolló el método SITE (single-injection thermal extinction) que evalúa el ensayo competitivo por el cambio térmico con una sola inyección. Usando este método de SITE, se realizó la validación de hits de unión de fragmentos hacia KSI. Se pudo obtener un compuesto hit tipo impulso por entalpía que mostró reacción exotérmica significativa y competencia con el sustrato de KSI DOC (Figura 2B). Además, se obtuvo también éxito en adquirir compuestos desde el cribado de fragmentos relativos a la proteína quinasa ERK2, involucrada en la cascada de señalización celular MAPK.

Como se puede ver, no solo en la optimización de medicamentos el ITC desempeña un papel importante, sino también en la etapa de exploración, el uso de evaluación térmica resulta potente. Generalmente, las reacciones exotérmicas están vinculadas a la creación de especificidad no covalente, con implicación frecuente de enlaces de hidrógeno. Sin embargo, diseñar racionalmente este tipo de enlaces no es tarea sencilla. De tal forma, encontrar pequeñas moléculas que formen enlaces de hidrógeno en etapas iniciales del diseño, para su posterior desarrollo sintético, se convierte en un enfoque eficaz para llegar a obtener compuestos líderes de alta calidad.

Ejemplo de Experimento 2: Análisis de ITC en Optimización de Moléculas Pequeñas⁶⁾

1. Proteína Objetivo

La proteína DJ-1, que ha ganado atención por su profunda implicación en enfermedades como el Parkinson y el cáncer (Figura 3A) fue seleccionada como objetivo. DJ-1 es conocida como una enzima que muestra actividad glioxalasa, pero la relación de esta actividad con enfermedades aún no está clara. Este estudio tiene como objetivo aclarar estas relaciones y explorar nuevas terapias mediante obtención de compuestos que muestren actividad inhibitoria contra DJ-1.

2. Exploración de Moléculas Pequeñas

Se seleccionaron compuestos candidatos prometedores a través del cribado SPR. Dentro de este grupo, el compuesto que posee un esqueleto Isatin fue seleccionado como prometedor hit (Figura 3B).

3. Validación de Hit (ITC)

El análisis ITC de los compuestos mostró que Isatin mostró un modo de unión del tipo impulso por entalpía para DJ-1, acompañado de una reacción exotérmica (ΔH = -11.6 kcal/mol, –TΔS = 4.1 kcal/mol, K_D = 3.2 μM) (Figura 3C). La –TΔS se calcula usando la ecuación ΔG = ΔH － TΔS, y K_D es calculado a partir de K_A = 1/K_D. El análisis de estabilidad térmica de DJ-1 mediante el método diferencial de fluorescencia (DSF) demostró que Isatin también mejoró la estabilidad térmica de DJ-1.

4. Análisis Estructural

El análisis de estructura de cocristal de Isatin y DJ-1 mostró una estructura compleja donde Isatin forma enlaces covalentes y no covalentes con múltiples cadenas laterales de aminoácidos, interaccionando con DJ-1 (Figura 4A, B). Basado en esta información estructural, el análisis de mutantes indicó que en solución Isatin interacciona con el sitio de unión en DJ-1 igual que en la estructura cristalina (Figura 4C).

5. Optimización del Compuesto

Usando la información de esta estructura compleja como base, se intentó mejorar la afinidad del compuesto. Logró exitosamente mostrar una afinidad de unión en el orden de nM para el compuesto #15 (Figura 5). El compuesto #15 contribuyó a la entropía (ΔH = -11.5 kcal/mol, –TΔS = 2.0 kcal/mol, K_D = 0.1 μM). Este compuesto también mejoró la estabilidad hacia DJ-1. Respecto a Isatin, se realizaron verificaciones de actividad inhibitoria intracelular para el hit obtenido. Ambos, Isatin y el compuesto #15, demostraron inhibir significativamente la actividad glioxalasa intracelular. Además, de manera intrigante, estos compuestos aumentaron significativamente la estabilidad térmica intracelular de DJ-1 al ser evaluados con el ensayo de cambio térmico basado en células (CETSA). Estos resultados demuestran que la validación de ITC permite seleccionar compuestos de impulso por entalpía, mediadores de especificidad, y que muestran que optimización estructural produce una contribución de entropía al crear complementación estructural. Este enfoque de ITC es efectivo en seleccionar compuestos que actúan específicamente contra la proteína objetivo también en el contexto celular.

Conclusión

En esta sección presentamos ejemplos de investigación relacionados con el uso de calorimetría en el desarrollo de fármacos de moléculas pequeñas. En el descubrimiento de inhibidores de moléculas pequeñas, normalmente se realiza selección basándose en alta actividad biológica, actividad inhibitoria y afinidad de unión elevadas. Sin embargo, hay veces que se continúa sin entender claramente las interacciones entre la molécula objetivo y el medicamento pequeño, ocasionando problemas al no lograr el diseño de lideres, o tener una mala correlación de estructura-actividad en optimización estructural. Recientemente, el enfoque en moléculas que van más allá de enzimas o receptores, como proteínas de membrana y proteínas desordenadas naturalmente, presentan complejidad bioquímica como objetivos. Estos objetivos moleculares son cada vez más difíciles de tratar y las técnicas de búsqueda de medicamentos y métodos de ensayo convencionales no funcionan para ellos. En muchos casos, los inhibidores de moléculas pequeñas deben actuar en superficies de interacción proteína-proteína (PPI) o interfaces de grandes complejos proteicos, resaltando su singularidad. Seleccionar compuestos que se unan específicamente a estas proteínas objetivo requiere técnicas de detección capaces de analizar de manera cuantitativa y altamente sensible el comportamiento de unión. Las mayores preguntas en el descubrimiento moderno de fármacos dirigidos a moléculas son cómo lograr alta afinidad y especificidad de unión al objetivo. Se requiere tecnología de búsqueda y análisis más refinada, y entre las posibilidades discutidas, se expone la utilidad de ITC. Aunque no se menciona en este capítulo, los autores han identificado dos compuestos, mediante cribado de inhibidores de moléculas pequeñas para la enzima del metabolismo de serina (SHMT), un objetivo de malaria y cáncer, como hits impulsados por entalpía y entropía respectivamente⁷. Los perfiles térmicos por ITC pueden ser útiles para especificidad en hits de moléculas pequeñas, obteniendo diseños moleculares racionalmente optimizados.

◆ Referencias
1) Ohtaka H & Freire E：Prog Biophys Mol Biol, 88：193-208, 2005
2) Muzammil S, et al：J Virol, 81：5144-5154, 2007
3) Carbonell T & Freire E：Biochemistry, 44：11741-11748, 2005
4) Kawasaki Y, et al：Chem Pharm Bull (Tokyo), 62：77-83, 2014
5) Kobe A, et al：J Med Chem, 56：2155-2159, 2013
6) Tashiro S, et al：ACS Chem Biol, 13：2783-2793, 2018
7) Nonaka H, et al：Nat Commun, 10：876, 2019

Calorímetro de titulación isotérmica (ITC) de Malvern Panalytical
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