¿Por qué es mejor que LALS esté más cerca? – Sistema GPC de Viscotek

 

Introducción 


  Actualmente, en los experimentos de GPC/SEC (cromatografía de permeación en gel/exclusión por tamaños), los detectores de dispersión de luz láser se utilizan ampliamente para medir el peso molecular.  

  Debido a la ventaja de que el peso molecular se mide directamente a partir de la señal del detector de dispersión de luz, muchos usuarios prefieren utilizar este método ya que no es necesario corregir el volumen de elución utilizando polímeros o proteínas estándar. Además, el peso molecular medido con el detector de dispersión de luz es independiente del tipo y estructura del polímero.  

 

  Por estas razones, el peso molecular medido por GPC-LS se denomina peso molecular absoluto. De hecho, todos los detectores GPC-LS requieren tareas de calibración, pero la mayoría de los detectores de LS actualmente en uso calculan el peso molecular mediante extrapolación o corrección de datos, por lo que hay una discrepancia significativa para llamarlos absolutos. 

 


  En esta nota de aplicación, se explica la teoría relacionada con este problema y se describe si LALS (dispersión de luz de ángulo bajo) es la única tecnología LS que mide el ángulo de la luz dispersada proporcionalmente al peso molecular.

Teoría de la dispersión de luz 


  Primero, es importante observar la correlación entre la capacidad medida (intensidad de la luz dispersada) y el resultado deseado (peso molecular promedio ponderado). Estos dos factores están vinculados por la conocida ecuación de Releigh. 

  Aquí, Rθ=0 representa la intensidad de dispersión a 0 grados, Mw es el peso molecular promedio, c es la concentración de la solución, K representa la constante óptica y dn/dc significa coeficiente de refracción, y A2 representa el segundo coeficiente virial. 

 


  En el caso de soluciones de baja concentración (por ejemplo, condiciones típicas de GPC), se puede ignorar este efecto debido a la concentración muy baja. Esto simplifica la ecuación de la siguiente manera. 

 


  Utilizando la ecuación simplificada, se puede calcular directamente Mw desde el valor de la luz dispersada.  Sin embargo, es importante entender que esta ecuación se refiere a la luz dispersada a 0 grados (por ejemplo, 0°).  

  Por supuesto, debido al haz láser incidente, es imposible medir la luz dispersada a 0°, por lo que se deben medir las luces dispersadas en varios ángulos diferentes (Figura 1). Sin embargo, esto complica el proceso ya que la cantidad de luz dispersada varía significativamente con el ángulo de dispersión y el tamaño molecular medido.  

  Solo para molecules con tamaño muy pequeño se puede ignorar este efecto de dependencia angular. Cuando el tamaño molecular es mayor de 12 nm, se presenta un problema en la solución. (1) 

 


De acuerdo con esta teoría, básicamente existen tres soluciones. 

 


1. Dispersión de Luz Multiángulo (MALS).
Mide la luz dispersada en más de un ángulo y extrapola los datos a 0 grados. 

 


2. Dispersión de Luz a 90°/Viscosidad (RALS/Viscosidad).
Mide la luz dispersada a 90° y utiliza datos de viscosidad para corregir el valor de 0°. 

 


3. Dispersión de Luz de Ángulo Bajo (LALS).
Mide a ángulo bajo cerca de 0° donde los efectos de ángulo se pueden ignorar, eliminando la necesidad de corrección.

  Aunque cientos de equipos que utilizan MALS y RALS/Viscosity se utilizan actualmente en todo el mundo, ninguno de estos productos mide el peso molecular directamente. 

 


  El enfoque multiángulo siempre depende de la extrapolación de datos, y el enfoque RALS depende del uso de un viscosímetro para ajustar los datos de moléculas de mayor tamaño.  

 


  Históricamente, el enfoque LALS ha sido considerado como la única técnica verdadera porque no requiere suposiciones de extrapolación o manipulación de datos como el Multiángulo.  

  Los detectores LALS comerciales fueron benchmarkeados con el Chromatix KMX-6, producido entre finales de los años 70 y mediados de los 80.  Sin embargo, en los años 90, no se produjeron detectores LALS.  

  Solo en 2001 se lanzó un nuevo detector LALS de Viscotek, abriendo nuevamente la oportunidad para que los usuarios de GPC-LS midan el peso molecular absoluto directamente. 

 

 

El problema con el enfoque Multiángulo

 


  Los dispositivos de Multiángulo funcionan midiendo la dispersión de luz en más de un ángulo y extrapolando luego estos puntos de medición a 0 grados. Sin embargo, una gran cantidad de usuarios tienden a pensar que los valores obtenidos son el peso molecular absoluto. 

  Sin embargo, en todos los equipos MALS es necesario realizar un procedimiento de calibración, por lo que decir que son valores absolutos no es cierto. Además, el peso molecular no es medido directamente, sino que se obtiene como resultado de la extrapolación de los datos. 

 


  Esta es la mayor debilidad del método MALS. Existen diferentes tipos de gráficos de datos de extrapolación o ajustes de extrapolación, ¿cuál deberíamos aplicar para cada muestra? Debye? Zimm? Berry? Para las moléculas pequeñas, los ajustes de gráficos lineales proporcionan resultados más precisos, mientras que para las moléculas más grandes, los ajustes de gráficos lineales proporcionan resultados más precisos, mientras que las moléculas más grandes requieren ajustes complejos. (2) 

 

  Para moléculas mayores de 45 nm, los gráficos de datos comienzan a curvarse y el peso molecular extrapolado varía en función de la línea de ajuste aplicada. Además, la selección puede verse afectada por la amplitud de la muestra, que combina tanto moléculas grandes como pequeñas. 

 


  Otro problema vinculado con el enfoque Multiángulo es la ausencia de datos en el área crucial de Low angle, los detectores Multiángulo están diseñados para recolectar datos de diversos ángulos, por lo que no pueden recopilar información precisa en ángulos bajos verdaderos. 

 

  Como resultado, se hace más difícil obtener el peso molecular exacto. La precisión de la extrapolación (adecuación de ajuste) depende de lo cerca que esté el punto de datos de menor ángulo respecto a 0 y de la calidad de la señal. (3) 

 

 

Dispersión de Luz en Ángulo Bajo (LALS)

 


  El enfoque avanzado de LALS mide la luz dispersa lo más cercano que sea posible a 0°, eliminando todos los problemas de extrapolación y ajuste de datos al medir cerca de 7°. 

 

  La Figura 2 muestra el modelo interno del camino óptico del detector. Este diseño eficiente distingue efectivamente el haz incidente de la luz dispersada (4). Como resultado, se puede obtener una relación señal/ruido excelente a 7°. 

 


  La Figura 3 compara la relación señal/ruido de bajo y alto peso molecular de polímeros a 90° (RALS) y a 7° (LALS). 

 


  En la Figura 3a, tanto el detector dispersado en 90° (RALS) como LALS muestran resultados coincidentes independientemente del ángulo de dispersión para una muestra de PEO de bajo peso molecular. El cromatograma apunta una superioridad en la relación señal/ruido de LALS cuando se compara directamente con señales a 90° (RALS). 

 


  La importancia de la medida directa de LALS se ve claramente en la análisis de macromoléculas tales como polisacáridos. Este tipo de entidades presentan una gran dependencia angular en la luz dispersada (ver Figura 3b), presentando así problemas significativos para RALS y especialmente en métodos Multiángulo. 

 

  Medir directamente la dispersión de luz a 7° permite calcular con precisión el peso molecular sin necesidad de ajustes de datos o extrapolaciones. La figura 4 detalla los resultados de la hialurónica obtenidos vía la perspectiva LALS. (5).
 

 

 

Conclución 

 


  El advenimiento de detectores LALS avanzados ha permitido a los laboratorios GPC/SEC medir con precisión el peso molecular de las muestras.  

 

  Usar LALS evita problemas relacionados con la extrapolación o ajuste de datos. Además, los productos LALS recientemente lanzados son pequeños y fáciles de operar, permitiendo integración efectiva con sistemas de detección múltiple incluyendo viscosímetros (6), y permitiendo así determinar tanto el peso molecular como la estructura molecular simultáneamente. (7, 8)  

 

  Esto desafía la percepción tradicional de que más ángulos es mejor. De hecho, al medir la luz dispersada, más cerca es definitivamente mejor.