MicroCal PEAQ-ITC con disolventes orgánicos: Consejos y precauciones

por Verna Frasca, Tuesday, 23rd June 2020

Resumen

Hay un interés creciente en las aplicaciones de Calorimetría de Titulación Isotérmica (ITC) que requieren disolver los componentes de unión en un disolvente orgánico. Estos incluyen reacciones químicas huésped: invitado, nanopartículas y materiales insolubles. Para obtener resultados exitosos, el protocolo experimental con disolventes orgánicos requiere una modificación menor de los métodos normales con tampones acuosos. Este blog incluye consejos para realizar experimentos exitosos con disolventes orgánicos en un sistema MicroCal PEAQ-ITC.

Si está utilizando otro MicroCal ITC o tiene más preguntas, póngase en contacto con su oficina local de Malvern Panalytical o con el servicio de asistencia.

Antes de usar disolventes orgánicos con un MicroCal PEAQ-ITC u otro sistema MicroCal ITC, revise estas precauciones antes de realizar cualquier experimento:

  • Malvern Panalytical no ha probado todos los componentes del instrumento con todos los disolventes orgánicos. Puede obtener una lista completa de los componentes de superficie mojada en la guía del usuario de MicroCal PEAQ-ITC, o su oficina regional de Malvern Panalytical (una lista parcial se encuentra a continuación). MicroCal VP-ITC e iTC200 usan algunos materiales diferentes.
  • Consulte las guías de resistencia química para obtener más información sobre componentes específicos del instrumento y disolventes de interés. Hay varias guías disponibles en línea.
  • Limite el tiempo que el PEAQ-ITC esté expuesto a disolventes orgánicos, y elimine completamente los disolventes orgánicos después de su uso. No mantenga disolventes orgánicos en las celdas o jeringa de ITC. Limpie cualquier derrame de inmediato.
  • Es posible que los gases volátiles de los disolventes se filtren en los componentes electrónicos del instrumento y dañen el núcleo de la celda. Esto es una reparación costosa.
  • No use disolventes orgánicos con el módulo de lavado PEAQ-ITC o el muestreador automático para el PEAQ-ITC automatizado, a menos que se sepa que el disolvente es compatible con TODOS los componentes del instrumento.
  • Conozca los riesgos humanos y ambientales de los disolventes orgánicos y las medidas preventivas. Use disolventes orgánicos en un laboratorio bien ventilado y equipo de protección personal adecuado. Deseche los desechos de disolventes orgánicos mediante métodos apropiados.

Aquí hay una lista de disolventes que se sabe son compatibles con MicroCal PEAQ-ITC:

  • Buffers acuosos entre pH2-pH12
  • 1 M NaCl
  • 50% DMSO
  • 50% acetonitrilo
  • 100% Metanol
  • 50% Etilenglicol
  • 20% Contrad 70
  • 14% Decon 90

Lista parcial de materiales de superficies mojadas en MicroCal PEAQ-ITC – Consulte las guías de resistencia química para disolventes específicos. Esta lista no incluye todos los componentes mojados del módulo de lavado ni todos los materiales utilizados en el autómata de muestreo PEAQ-ITC.

  • Aleación Hastelloy C276: células ITC
  • Acetal (también llamado Delrin): Copas de desbordamiento del puerto de la célula ITC
  • Acero inoxidable 316: jeringa de inyección, jeringa de carga manual de células, puertos de células ITC
  • Acero inoxidable 303: tuerca de jeringa de inyección
  • PEEK: adaptador del puerto de llenado (FPA), módulo de lavado
  • Kalrez: adaptador del puerto de llenado (FPA)
  • PTFE: pipeta de inyección, manguito del cojinete de la jeringa de inyección, jeringa de carga manual de células
  • Vidrio de borosilicato: jeringa de inyección, jeringa de carga manual de células
  • Tygon 2375: Tubos para el módulo de lavado y el ensamblaje del FPA
  • Polipropileno: Conexiones rápidas para el módulo de lavado y el ensamblaje del Adaptador del Puerto de Llenado (FPA)
  • FEP (propileno etileno fluorado): Funda para jeringa de carga manual de células
  • NOTA: algunos disolventes orgánicos pueden ablandar los tubos de 0.2 mL utilizados para llenar la jeringa de inyección y degradar el adhesivo utilizado para ensamblar la jeringa de carga manual de células.

Cómo realizar experimentos con disolventes orgánicos

Preparación de muestras con disolventes orgánicos:

  • Cada socio de enlace para la titulación ITC necesita estar en un disolvente idéntico. Cualquier discrepancia debido a otro disolvente o aditivo resultará en un gran calor de fondo.
  • Use disolventes secos, suministrados en ampollas selladas o secos con un tamiz molecular. Esto reducirá la contaminación por agua durante el experimento ITC.
  • La muestra debe ser pura, sin materiales adicionales, aditivos, disolventes, etc.
  • Pese cuidadosamente las muestras y mézclelas con el disolvente. Úselo de inmediato para evitar cambios de concentración, contaminación por humedad, etc.
  • Si necesita reemplazar un disolvente con otro antes de ITC, asegúrese de que todo el disolvente inicial se elimine de la muestra mediante el método apropiado (es decir, liofilización).
  • Si está utilizando un disolvente mixto (es decir, 50% de acetonitrilo/50% de agua): estos son muy difíciles de igualar exactamente. Asegúrese de realizar titulaciones de control apropiadas.
  • La desgasificación de muestras antes de ITC puede no ser eficaz para disolventes orgánicos. Tenga cuidado con la posible desgasificación al llenar la celda ITC y la jeringa
  • Si está utilizando un disolvente volátil, observe que las concentraciones de las muestras en la celda ITC y la jeringa probablemente cambiarán durante el almacenamiento y durante el experimento ITC, debido a la evaporación del disolvente

Preparación de celdas MicroCal PEAQ-ITC y jeringa de inyección para experimentos con disolventes orgánicos

Antes del 1er experimento:

  • Limpie las celdas de muestra y de referencia ITC y la jeringa de inyección con 20% de Contrad 70 (o 14% de Decon 90), seguido de varios enjuagues con agua para eliminar proteínas y otros contaminantes. Repita la limpieza si es necesario. Quite el agua.
  • Enjuague la jeringa de inyecciones ITC con metanol, luego séquela con la bomba PEAQ-ITC para eliminar el metanol.
  • Enjuague las celdas de muestra y de referencia ITC con metanol, usando la jeringa de llenado manual de células. Retire el metanol.
  • Con las celdas ITC vacías, termostatice a 60°C, durante 30-60 minutos para evaporar el metanol. Esto secará las celdas ITC.
  • Termostatice las celdas ITC a la temperatura experimental.
  • Llene la celda de referencia con el disolvente experimental (no use agua)
  • Llene la celda de muestra con la muestra en el disolvente.
  • Llene la jeringa de inyección con la muestra en el disolvente

Entre experimentos con el mismo disolvente:

  • Retire la muestra de la celda de muestra con la jeringa de carga manual de células. Enjuague la celda con disolvente varias veces, usando la jeringa de carga manual de células. Llene la celda de muestra con nueva muestra + disolvente.
  • Enjuague la jeringa ITC varias veces con disolvente. Utilice el adaptador del puerto de llenado conectado a la jeringa, evitando el módulo de lavado PEAQ-ITC. Llene la jeringa con muestra + disolvente.
  • Reemplace el disolvente en la celda de referencia si ha habido evaporación.

Después del experimento final en disolvente orgánico:

  • Retire la solución de disolvente de las celdas de muestra y referencia con la jeringa de carga manual de células. Si el disolvente no es miscible con el agua, enjuague las celdas ITC varias veces con metanol con la jeringa de carga manual de células. Siga con lavado de solución de agua y detergente. Enjuague con agua y deje agua fresca en las celdas de muestra y referencia.
  • Si el disolvente no es miscible con el agua, enjuague la jeringa ITC varias veces con metanol, luego con solución de agua y detergente. Enjuague con agua y metanol, almacene la jeringa seca
  • Si el disolvente no es miscible con el agua, enjuague la jeringa de llenado de células manuales varias veces con metanol, luego con solución de agua. Almacene la jeringa seca
  • Asegúrese de que se limpien derrames de disolventes orgánicos en el instrumento

Diseño experimental sugerido y experimentos de control

  • Para MicroCal PEAQ-ITC: 25 °C, 19 X 2 µL inyecciones, intervalo de 150 segundos, agitación a 500-750 rpm (se sugiere velocidad de agitación por debajo de 1000 rpm para disolventes orgánicos).
  • Puedes necesitar una velocidad de agitación más lenta para reducir el ruido en la línea de base entre inyecciones y/o una temperatura diferente
  • Si hay cambios en la línea de base, esto podría deberse a burbujas en la celda ITC y/o jeringa
  • Es importante realizar varias titulaciones control ITC para asegurarse de que los cambios de calor observados se deben a la unión, no a otro proceso o desajustes de disolventes
    • Agua titulada en agua: esta es la prueba recomendada para la función general de ITC
    • Disolvente titulado en disolvente
    • “Ligando/invitado” + disolvente en jeringa ITC, titulado en disolvente solo en celda ITC
    • Solo disolvente en jeringa ITC, titulado en “macromolécula/anfitrión” + disolvente en celda ITC
    • Todos estos experimentos de control deberían dar cambios pequeños y reproducibles por inyección, con poco ruido
  • Si los cambios de calor por inyección son mayores de lo esperado para controles y/o experimentos, busque fuentes de contaminación por humedad y desajustes de disolventes, y asegúrese de que las celdas ITC y la jeringa fueron limpiadas.
  • Si no hay evidencia de unión y/o saturación de unión, también verifique concentraciones.

Ejemplo: Interacción huésped – invitado en Acetonitrilo

  • Datos ITC brutos (arriba) y ajuste de datos a un modelo de conjunto de sitios (abajo) para la reacción de reconocimiento huésped-invitado en acetonitrilo
  • “Invitado” en la jeringa a 17.5 mM y “huésped” en la celda a 0.7 mM.
  • Experimentos realizados con MicroCal PEAQ-ITC, analizados con software PEAQ-ITC.
Datos ITC brutos (arriba) y ajuste de datos a un modelo de conjunto de sitios (abajo) para la reacción de reconocimiento huésped-invitado en acetonitrilo

Lecturas adicionales:

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