Medición de la movilidad electroforética de las proteínas – Zetasizer Nano ZSP

Medición de la movilidad electroforética de las proteínas usando Zetasizer Nano ZSP 

 

 

Introducción  

 


   Zetasizer Nano es un producto líder en el mercado en el ámbito de las tecnologías de dispersión de luz dinámica y dispersión de luz electroforética para medir el tamaño hidrodinámico y la movilidad electroforética.  

 

   La dispersión de luz dinámica (DLD) se utiliza ampliamente en el análisis de las características de las proteínas y sus formulaciones, permitiendo no solo la medición del tamaño de las moléculas sino también la evaluación de la estabilidad.  

 

   Recientemente, a medida que el uso de proteínas como terapéuticos biológicos ha aumentado rápidamente, la estabilidad proteica en solución ha atraído un gran interés científico y comercial. La comprensión de la estabilidad y comportamiento de las formulaciones es crucial para crear productos seguros y comercializables, por lo que la demanda de herramientas para analizar estas características está creciendo.  

 

   La movilidad medida por dispersión de luz electroforética (DLE) de proteínas es un indicador clave para confirmar el comportamiento de la formulación y la estabilidad en la viscosidad[1].
 

   La medición experimental de la movilidad de las proteínas presenta dos retos prácticos.  

 

(i) Manipular soluciones proteicas generalmente significa manejar concentraciones diluidas. El término DLD implica tratar con un nivel bajo de luz dispersada proporcionales al tamaño pequeño de pocas moléculas. Hasta la fecha, la mayoría de los equipos basados en dispersión de luz en el mercado no han proporcionado la sensibilidad necesaria para tales mediciones.  

 

(ii) Para medir la movilidad de las proteínas, es necesario aplicar un campo eléctrico al muestra, lo que puede inducir agregación y dañar las proteínas de forma física[2]. Como resultado, los resultados de la medición de movilidad pueden reflejar la agregación molecular en lugar de los propios objetivos de proteína. 

 


Para una medición precisa y exacta de la movilidad de las proteínas, se necesitan tres requisitos.
1. Un equipo con suficiente sensibilidad para medir tanto la baja movilidad electroforética como la baja tasa de conteo relativas a la dilución de proteínas
2. Técnicas de medición que mitiguen el riesgo de agregación
3. Procedimientos automatizados inteligentes que reconozcan y minimicen la agregación  

   El Zetasizer Nano ZSP (ZSP, figura 1A) y su software relacionado se han desarrollado específicamente para cumplir con estos requisitos. Al medir la movilidad de muestras con concentraciones tan bajas como 1mg/mL para lisosima, por ejemplo, es posible analizar partículas pequeñas y muestras de baja concentración gracias a la sensibilidad de dispersión de luz del equipo. Además, la técnica de dispersión de luz por desplazamiento de fase (PALS) en el ZSP mejora el desempeño de la medición para muestras como proteínas con baja movilidad.  

 

   Científicos de Malvern Instruments han descubierto que la mayoría del fenómeno de agregación que ocurre durante el proceso de medición electroforética sucede en los electrodos[3]. Usando el método de barrera de difusión inventado por Malvern Instruments y en espera de patente (figura 1B), se puede proteger las muestras de proteínas al separarlas de los electrodos de la celda[2, 4].  

 

   Esto permite aplicar un voltaje por un tiempo prolongado desde el equipo para obtener más datos confiables[3]. El método de barrera de difusión se ha referenciado en la norma ASTM más reciente sobre la medición de movilidad de nanomateriales biológicos [2]. 

 


   El software Zetasizer para Zetasizer Nano ZSP también incluye un protocolo especializado para la medición de movilidad de proteínas. Este método de medición reduce el voltaje para evitar la agregación y controla cuidadosamente la temperatura dentro de la celda para prevenir que la muestra se aglomere.  

 

   Antes y después de la medición de la movilidad, el sistema mide también el tamaño utilizando exactamente el mismo instrumento óptico (figura 2). Por lo tanto, la distribución del tamaño de partículas medida representa directamente la población cuya movilidad se está midiendo. Si se utilizara un equipo óptico diferente para medir el tamaño respecto a la movilidad, la intensidad de la dispersión de luz podría variar, ocultando los agregados formados. Por eso, es preferible usar el mismo aparato óptico para las mediciones de tamaño y movilidad. Usando el mismo equipo óptico antes y después de medir la movilidad, el Zetasizer Nano ZSP identifica cualquier agregación inadvertida que podría haber ocurrido durante el proceso de medición. 

 


   Por último, la medición precisa de la movilidad electroforética de las proteínas permite calcular su carga con base en la relación conocida entre movilidad y carga proteica[5].  

 

   Utilizando la nueva opción de calculadora del software de Zetasizer, se puede calcular. Esta nota de aplicación describe la medición de la movilidad de proteínas usando el ZSP. Usando la sensibilidad del ZSP, el método eficiente de barrera de difusión, y un protocolo de medición adecuado, se pueden obtener los resultados más precisos posibles.
 

Método
 

   Se prepararon soluciones de albúmina sérica humana (HSA) en dos tipos diferentes de tampón hasta alcanzar una concentración final de aproximadamente 2mg/mL. Las condiciones del tampón utilizado son los siguientes. 

 

 1) El tampón pH7 con el que la proteína se disolvió originalmente, 2) Tampón citrato a pH 4.3. Antes de la medición, las muestras se filtraron a través de un filtro de 0.02μm para eliminar los efectos de agregados.  

 

   El método de barrera de difusión se utilizó para prevenir que las muestras entren en contacto con los electrodos de la celda y se aglomeren. Se llenaron abundantemente celdas capilares plegables desechables. Utilizando el extremo de una pipeta de carga de gel, se cargaron 20μL de HSA (2mg/ml) en la parte inferior de la celda en el área por donde pasa la luz. Después de insertar la celda en el equipo, se adquirieron medidas de tamaño y voltaje zeta. 

 

   El tamaño hidrodinámico y la movilidad de HSA fueron medidos usando el Zetasizer Nano ZSP mediante DLD y DLE, respectivamente. Ambos tamaño y movilidad fueron medidos en el mismo ángulo de dispersión para confirmar que el voltaje zeta obtenido corresponde al de las proteínas y no de las sustancias agregadas. 

 


Resultados 

 


    

   Las figuras 3A y 3D muestran la distribución del tamaño de las muestras medidas al inicio del experimento a pH 7 y pH 4.3, respectivamente. Como se esperaba, se confirmó la existencia de una única pico en la distribución de tamaños. A un pH de 7, el tamaño es de 3.8nm, el tamaño reportado para el HSA se ajusta bien a este dato.  

 

   Curiosamente, a un pH de 4.3, el tamaño es de 4.1nm, algo mayor que a pH 7. No se puede determinar si esto es un indicio de un cambio estructural o de una reacción de oligomerización de mayor nivel, o incluso de los primeros signos de agregación con este método. 

 

   Luego se inicia la medición de la movilidad y se calculan los resultados. Las figuras 3B y 3E muestran el espectro de frecuencia en la medición de movilidad. Estudiar el espectro de frecuencia es un buen método para evaluar la calidad de la medición[6].  

 

   Debido a su pequeño tamaño, las proteínas difunden muy rápidamente. En el proceso de medición de la electroforesis, las proteínas se encuentran en estado electroforético; sin embargo, su tasa de difusión no es completamente superada por la electroforesis.  

 

   Como resultado, el corrimiento de frecuencia de la luz dispersada presenta picos amplios debido a la importante presencia de componentes de difusión. Como los agregados son más grandes, el espectro de frecuencia de muestras que contienen aglomerados tiene un componente de difusión mucho menor, resultando en picos más altos y agudos. Esto se explica en mayor detalle en la nota de aplicación MRK1651-02 y la referencia [4]. Aquí, el espectro de frecuencia presenta picos anchos y bajos, indicando que la medición se realizó predominantemente en proteínas, no en agregados.
 

   La movilidad electroforética medida para HSA a pH 7 fue -0.88±0.2μmcm/Vs, y a pH 4.3 fue 0.44±0.2μmcm/Vs. Estos resultados confirman que el punto isoeléctrico de la muestra se encuentra entre estos dos valores de pH. 

 


   Cuando se mide la movilidad electroforética, el nuevo calculador del software Zetasizer permite calcular la carga total de la proteína a partir del tamaño hidrodinámico y la movilidad electroforética medidas. En la figura 4, la carga calculada para el HSA a pH 7 es aproximadamente -18, mientras que a pH 4.3 la carga calculada es aproximadamente +10. 

   Las figuras 3C y 3F muestran la distribución de tamaño posterior a la medición de movilidad. Los resultados indican que solo se produjo una mínima aglomeración durante el proceso de medición.  En ambos casos, el pico principal de la distribución representa el 99% de la luz dispersada a pH 7 y el 90% de la muestra a pH 4.3.

 

   Por lo tanto, los resultados basados en esta movilidad son confiables. Se observó que la muestra a pH 4.3 tiende a aglomerarse con el tiempo en ausencia de campo eléctrico, lo que probablemente se deba al bajo pH.  Este efecto también es la razón por la cual se produce una pequeña cantidad de aglomeración durante la medición.

 


Discusión 

 


   Los resultados generales proporcionan una movilidad medida similar a valores ya conocidos. Además, se puede observar que la movilidad de las proteínas medidas es especialmente evidente a valores de pH bajos como se esperaba. La repetibilidad y excelencia de la medición otorgan gran confianza en la precisión de los resultados. Esto se corrobora en las mediciones consecutivas de DLD con un espectro de frecuencia amplio y niveles mínimos de aglomeración.
 

   La carga de la proteína calculada se comparó con el estudio realizado por Tanford[2]. Tanford mostró que a pH7, el HSA tiene una valencia de aproximadamente -16, por lo que el resultado coincide bien con lo presentado aquí. Y a pH 4.3, mostró una valencia de aproximadamente +20.  

 

   Esto es más seguro que los datos presentados aquí. Podría haber muchas razones posibles, como los tampones utilizados y las fuentes de HSA utilizadas en los experimentos, pero la concordancia general en los valores puede explicarse claramente mediante la referencia [6]. 

 


   El Zetasizer Nano ZSP, junto con su software y el método de barrera de difusión, aseguran mediciones confiables y precisas durante el proceso real de medición. Esto se logra de tres maneras diferentes. 

 


   1. El método de barrera de difusión evita que las muestras de proteínas se agreguen en los electrodos.
   2. El software de Zetasizer automatiza la optimización y medición tanto del tamaño de las proteínas como del voltaje zeta para reducir la intervención del usuario y mejorar la precisión de la medición.
   3. El Zetasizer Nano ZSP proporciona confianza en la precisión de la medición al usar el mismo conjunto óptico de excelente sensibilidad para medir tamaño y voltaje zeta. 

 


   En conclusión, la movilidad de HSA se midió exitosamente a 2mg/mL de concentración en tampón pH7 y pH4.3. El método de barrera de difusión solo requiere una pequeña cantidad de muestra de proteína (20μL en este caso), por lo que las mediciones se pueden lograr con costos mínimos de muestra. 

[1] Laue, Proteinas en suero – Coloides vs vistas moleculares, presentación en el Conference de estabilidad de proteínas en Colorado, 2011
[2] ASTM2865 – Guía estándar para la medición de la movilidad electroforética y el potencial zeta de materiales biológicos de tamaño nanométrico
[3] Corbett, Connah & Mattison, Electrophoresis. En prensa 2011
[4] Corbett, Connah & Mattison, Patente pendiente
[5] Loeb, A.L, Wiersema, P.H. y Overbeek, (1961) «La doble capa eléctrica en torno a una partícula coloidal esférica» MIT Press, Cambridge Mass
[6] Corbett & Jack, Colloids & Surfaces A: Aspectos fisicoquímicos e ingenieriles. (2010) 376 pp31-41