Radio Hidrodinámico – Radio de Gyración

El tamaño importa: Radio Hidrodinámico vs Radio de Gyración (Rh versus Rg)

Bienvenidos a la segunda entrega de la serie de blogs que sigue a nuestro exitoso webinar de C&EN sobre los análisis cualitativos y cuantitativos de proteínas.

En esta serie de blogs, estamos abordando algunas de las preguntas interesantes planteadas por los miembros de la audiencia. Hoy analizaremos la diferencia entre radio hidrodinámico (Rh) y radio de gyración (Rg), y lo que significan para la caracterización de proteínas.

De los muchos parámetros que describen el tamaño de una molécula, los dos más comúnmente usados son el radio hidrodinámico (Rh) y el radio de gyración (Rg). Ambos parámetros le dirán qué tan grande o pequeña es su molécula, pero usando diferentes medios para llegar a un valor de tamaño… y, quizás más confusamente, sus respuestas no serán las mismas, ¡pero tampoco estarán equivocadas!

Rh, medido por dispersión dinámica de luz, se define como el radio de una esfera dura equivalente que difunde a la misma velocidad que la molécula bajo observación. En realidad, las soluciones de proteínas y sus complejos no existen como esferas duras y, por lo tanto, el radio hidrodinámico determinado refleja más fielmente el tamaño aparente adoptado por la molécula solvatada y que gira. Por otro lado, Rg se define como la distancia promedio ponderada por masa desde el núcleo de una molécula hasta cada elemento de masa en la molécula. Para macromoléculas con radios mayores a 10 nm, Rg se determina clásicamente usando dispersión de luz en ángulo múltiple; una técnica que se basa en medir una diferencia en la intensidad de la luz dispersada en diferentes ángulos, conocida como dependencia angular. Las moléculas con radios menores a 10 nm, que representan la mayoría de las proteínas conocidas, dispersan la luz de igual manera en todos los ángulos (dispersores de Rayleigh) y, por lo tanto, no muestran dependencia angular. Por ende, no es posible determinar Rg para proteínas de esta manera. Sin embargo, es posible obtener Rg para proteínas y moléculas pequeñas usando otras técnicas como la dispersión de neutrones a ángulo pequeño (SANS) y la dispersión de rayos X a ángulo pequeño (SAXS) o a partir de estructuras de rayos X de alta resolución.

Para proteínas y sus complejos, Rg y Rh siempre estarán en el mismo orden de magnitud, pero ¿qué significan realmente estos parámetros de tamaño para la caracterización de proteínas? 

Para responder a esta pregunta, necesitamos analizar tres áreas clave de la caracterización de proteínas. En primer lugar, poder medir el tamaño ofrece una manera simple de confirmar la identidad y el estado oligomérico de una proteína en una preparación, dado el conocimiento a priori de su tamaño monomérico. Por lo tanto, es fácil ver cómo el cribado de tamaño puede implementarse en los laboratorios de producción de proteínas para identificar fracciones relevantes de proteínas purificadas o para verificar la consistencia entre lotes de formulaciones.

En segundo lugar, los procesos biológicos ocurren en solución; por lo tanto, el interés en estudiar y caracterizar proteínas está firmemente arraigado en comprender, y en última instancia controlar, el comportamiento de las proteínas. Se cree que, si se comprende el comportamiento de las proteínas en solución, entonces se puede predecir la interacción con otras biomoléculas, fármacos y entre sí. Esta información puede llevarse un paso más allá y usarse para manipular las soluciones de proteínas con el fin de provocar un resultado específico, por ejemplo, el desarrollo de formulaciones. De esto, está claro que Rh es un parámetro biológicamente relevante ya que considera el tamaño de la proteína en el contexto de su entorno.

Tanto Rg como Rh se pueden utilizar para obtener información sobre la tercera área clave de la caracterización de proteínas: la estructura. La forma en que se calcula Rg significa que el valor en sí es ligeramente más dependiente de la estructura de la molécula de interés que el valor de Rh. Pero es la relación entre Rg y Rh (Rg/Rh) la que realmente proporciona información sobre la forma de una molécula de proteína. El valor característico de Rg/Rh para una proteína globular es ~0.775, lo que significa que Rg es menor que Rh. Sin embargo, cuando las moléculas se desvían de estructuras globulares a no esféricas o alargadas, entonces Rg/Rh tiende a valores superiores a 0.775, ya que Rg se vuelve mayor que Rh.

Experimentalmente, es importante recordar que para proteínas Rg no puede obtenerse mediante técnicas de dispersión de luz estática y que Rh puede ofrecer una ruta alternativa a la información de forma a través de la teoría de Perrin.

En resumen, los valores de Rg y Rh no deben usarse uno en lugar del otro, pero cada uno ofrece una perspectiva diferente de la proteína en cuestión. Además del valor de la información proporcionada por el tamaño molecular, muchas características de la medición en sí misma deberán considerarse, por ejemplo, el tiempo de análisis, la concentración, el volumen de la muestra, el presupuesto, para establecer el valor real para el usuario.

Próximamente…

Esté atento a la próxima entrega de esta serie de blogs en la que arrojaremos luz sobre el punto de agregación y cómo se relaciona con la estabilidad de las proteínas y formulaciones bioterapéuticas.