Camino al Maestro del Calorímetro Vol. 8
Vamos a medir RNase A con DSC Parte 2

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Los personajes y la historia aquí presentados son ficción.
En cuanto al contenido técnico, el profesor Fukada de la Universidad Prefectural de Osaka nos ha proporcionado su asesoramiento.

Desde el botón «Descargar» al final de la página, puedes descargar el «Procedimiento de Análisis VP-DSC» mencionado en el texto.

Continuación de la Parte 1

La línea base de la medición de control está estable. Cuando llegue a 30°C, quita el tapón de presión y llena la muestra. Desgasifica la muestra usando ThermoVac con Timer. Una vez terminada la desgasificación, quita el tapón de presión y coloca el tapón de presión en el sensor de presión. Esta vez no usaremos el embudo de llenado, pero insertaremos cuidadosamente la aguja conectada a la jeringa con tapa lure en la celda, evitando golpear el fondo, y retiraremos el tampón de la celda de muestra. Desgasificación completa de la muestra. PreScan Thermostat terminado en 15 minutos, pasando a Equilibrio Final. El valor DP está acercándose a cero, ¡así que todo bien!

¿Señora Nakamura, todo bien?

	Sí, no parece que haya problemas con el valor DP. Solo queda esperar los resultados de la medición.

A propósito, ¿cambiaste el Número de Escaneos?

	Oh, se me olvidó. Voy a cambiar el número a 11 y hago clic en Actualizar Param. de Ejecución. Qué peligroso.

	No te preocupes, aún puedes hacerlo después de que comience la medición. Sin embargo, nos preocuparíamos si algo sucede mientras se están recopilando los datos.

Mantendré eso en mente.

	Señora Nakamura, obtuvimos buenos datos.

Gracias. Pero, la línea base está subiendo. Fue lo mismo durante la medición de agua-agua. ¿No es esto un problema?

	Se cree que esta inclinación ocurre porque los volúmenes de las celdas de muestra y referencia no son exactamente los mismos. Se trata de una deriva del sistema que es inevitable. Sin embargo, en los experimentos de DSC, siempre restamos los datos de medición de control de los datos de muestra, así que si hay una deriva similar, se compensará y no será un problema.

En otras palabras, la calidad de los datos depende de la coincidencia de la inclinación de la línea de base, ¿verdad?

	Exactamente.

Si la inclinación no coincide, ¿podría ser porque hay burbujas de aire en las celdas?

	Exactamente. Si la reproducibilidad de la línea de base es deficiente, lo primero que hacemos es sospechar de burbujas. La causa de estas burbujas podría ser células sucias.

	¡Así que, tanto para ITC como DSC, mantener las celdas limpias es crucial!

	Sí, mantener las células limpias es muy importante. Además, si la composición del tampón difiere, también podría llevar a una deriva de la línea de base, así que ten cuidado.

	Una cosa más. Es importante que la respuesta de la muestra esté por debajo de la respuesta de control. Esto también ha ocurrido en este caso.

Sí, así es, pero ¿por qué es eso?

	Cuando comparas el control, es decir, el tampón, con la solución de muestra, se espera que la concentración molar de moléculas de agua sea menor en la muestra ya que contiene proteínas. La capacidad calorífica del agua es mayor que la de las proteínas, así que, al tener más cantidad, genera más calor.

Ya veo. Entonces, si la muestra resulta tener un valor superior, ¿qué podría estar ocurriendo?

	Esto podría ocurrir si la composición del tampón es parcialmente diferente.

	Entonces, voy a proceder a limpiar y apagar el sistema.

Buen trabajo, señora Nakamura. A continuación, seguiremos con el análisis.

	Bueno, seguiré las instrucciones del manual por ahora.

Vaya, no encuentro este ícono en el escritorio…

	Es posible que, dependiendo de cuándo se adquirió, no encuentres el ícono de MicroCal, LLC DSC en el escritorio, sino el Launcher de Análisis de MicroCal. En ese caso, haz doble clic en este ícono y selecciona VP-DSC desde el botón MicroCal Data Analysis Click to Start. El resto de los pasos siguen el manual.

Tengo diez escaneos de datos de control, ¿cuál debería seleccionar? Supongo que lo mejor es usar los datos de control más cercanos a la muestra…

¿Señora Nakamura, en qué está pensando?

Hay 10 escaneos de control, pero en este caso, ¿debo usar el décimo escaneo más cercano a la muestra?

Exacto. Cuantas más veces repitas el escaneo, mejor será la reproducibilidad; en este caso, el décimo escaneo debería valer. Aunque, si hay ruido de picos en el último escaneo de control, debemos seleccionar uno anterior.

	De acuerdo, entiendo. Gracias. Entonces, llamaré a dos archivos: el escaneo número 11 de la muestra y el escaneo número 10 del control.
	Nota: Aunque el software de análisis muestra Kcal/mole, lo correcto es kcal/mol.

Señora Nakamura, parece que el análisis también va bien.

Es cierto, pero hay dos valores de ΔH. Los valores son aproximados, pero ¿cuál debería adoptar?

Señora Nakamura, ya nos ha preguntado esto antes, ¿verdad?

¿Tienes razón?

Se trata de la diferencia entre el cambio de entalpía calimétrica (ΔHcal) y el cambio de entalpía de Van’t Hoff (ΔHvh), señora Nakamura.

	¡Ay, lo olvidé!

La que tiene la v debajo de ΔH es el cambio de entalpía de Van’t Hoff. Dado que los valores son cercanos, eso indica que RNase A es una proteína de dos estados de transición.

Así es. Con una muestra como esta, se puede realizar un análisis utilizando un modelo de dos estados.

	Por cierto, profesor. El Kit de Pruebas advierte «integrar desde 0». ¿Qué significa eso?

En el software de análisis, hay una función que usa la información de los picos, después de haber restado la línea de base, para determinar el cambio de entalpía y Tm.

	Permítanme añadir. Aunque «Integrate from 0» no está en el manual simplificado en japonés, cuando realizó el análisis usando el ajuste, el proceso de restar la línea de base antes del ajuste fue el mismo. Los pasos siguientes son estos:

¡Oh! Tm y NDH son diferentes de cuando hice el ajuste…

	El método de «Integrate from 0» determina Tm considerando el tope del pico, mientras que el ajuste busca la temperatura en la que el área ajustada del pico (rojo) se reduce a la mitad. Por eso hay ligera discordancia en los valores. Observando el resultado del ajuste, hay discordancia entre los datos medidos y la curva de ajuste, ¿verdad?

Es cierto. Pero, ¿hasta dónde se considera permisible esa discrepancia?

Cuando preguntamos a los de Malvern, mencionaron que si la desviación estándar es menor al 2%, no hay problema.

Dado que ΔH es 1.026E5 cal/mol (1.02 kcal/mol), el 2% sería 2052 cal/mol, por lo que 409 cal/mol está dentro del margen de error.

Así es.

Además, en cuanto a la pregunta que hizo la señora Nakamura anteriormente, cuándo usar ajuste o no depende de la persona que mide. Para una transición de dos estados, tanto el ajuste como los resultados de «Integrate from 0» son generalmente similares, pues es probable que el pico sea simétrico, lo que hace que Tm se aproxime al tope. En caso de no ser una transición de dos estados, el pico puede no ser simétrico y Tm no sería el tope. Lo importante es analizar y comparar usando el mismo método siempre.

Desde el botón abajo, puedes descargar el «Procedimiento de Análisis de Datos VP-DSC» mencionado en el texto.
(Es el mismo disponible desde Parte 1.)

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