El camino hacia convertirse en un maestro del calorímetro Vol.1 (continuación) ¿Qué es un microcalorímetro?
Nakamura: «En los materiales del seminario, se resumen de manera sencilla las generalidades de ITC y DSC, junto con ejemplos de medición, lo que me dio una idea de qué datos se pueden obtener y qué información se puede obtener de ello. Sin embargo, parece que no se explica cómo se realizan realmente las mediciones… Empecemos investigando sobre ITC. iTC200 bien…
El MicroCal iTC200 de Malvern… es esto…
Sitio web de MicroCal iTC200
※El iTC200 ha dejado de venderse desde el 31 de marzo de 2017.
Consulte los PEAQ-ITC actualmente a la venta.
Ah, también hay una película. Dentro de la célula de muestra, cuando las muestras reaccionan y generan calor, se produce una diferencia de temperatura con respecto a la célula de referencia, por lo que controlan para eliminar dicha diferencia… eso es. Cuando se produce calor, la señal sale baja para reducir la temperatura de la célula de muestra, esa es la razón. Mmm, ya veo. Pero parece que esto puede verse muy afectado por el ambiente exterior. ¿Estará bien con el aire acondicionado?
Parece que también hay una explicación del principio
Estos son datos que se ven a menudo en artículos científicos. Pero, ¿por qué se determina la constante de disociación a partir de estos datos?
¿Se determina KD con la tangente?
ΔH, la entalpía, es la cantidad de cambio en el eje vertical, ¿verdad? ¿Hmm? La unidad del eje vertical ha cambiado. Ahora es el cambio de energía por mol de muestra titulada.
Quizás hay más detalles en la página de tecnología.
Veámosla.
Página de tecnología de calorimetría de titulación isotérmica
«Cada pico se integra finalmente y se plotea frente a la relación molar del ligando con respecto a la proteína. Como resultado, la curva de titulación isotérmica que se obtiene se ajusta a un modelo de unión del que se extrae la afinidad (KD).» Por lo tanto, no están obteniendo la constante de disociación con la tangente, sino que están ajustando con una fórmula teórica.
«La relación de unión se determina por la relación molar en el punto medio de la curva de titulación isotérmica.» Entonces, ¿eso significa cuántos sitios de unión hay en el lado de la muestra de la célula? ¿Por qué se puede determinar la relación de unión con la relación molar en el punto medio?
El cambio de entalpía era la variación del eje vertical, pero aquí se menciona «Mecanismo de unión». ¿Por qué la entalpía es el mecanismo? ¡Y la entropía no aparece!
Hmm, no entiendo…
Pero parece que preparar muestras es fácil porque no requiere etiquetado ni inmovilización. Se menciona que «cuando el ligando se une a la proteína, se produce un cambio de milésimas de grado centígrado». Supongo que es un dispositivo que detecta cambios de temperatura tan pequeños. Bueno, sería problemático si, al unirse, se produjeran cambios tan grandes como para alterar la temperatura corporal.
¿En qué campos es útil el ITC…?
«El ITC se utiliza ampliamente en el descubrimiento y desarrollo de fármacos con los siguientes propósitos.»
«Cuantificación de la afinidad de unión,» es decir, parámetros que se determinan con ELISA, RI, SPR, etc. No hay inmovilización ni etiquetado, y no hay necesidad de lavar, lo que permite obtener reacciones en un estado más natural, ese es el beneficio, ¿cierto?
«Selección y optimización de candidatos a fármacos,» ¿se trata de hacer una criba basándose en la fuerza de la unión?
«Evaluación termodinámica y medición de concentración activa.» Los parámetros termodinámicos son información útil durante el análisis estructural, pero ¿qué significa medición de concentración activa? ¿Se refiere al «control de calidad de proteínas» que estaba en los materiales de Interphex?
«Evaluación de las características del mecanismo de acción,» no estoy seguro de qué se refiere. ¿Significa el mecanismo de unión?
«Verificación de los targets de unión en el descubrimiento de fármacos de baja masa molecular,» ¿criba? Pero no parece tener un rendimiento muy alto…
«Comprensión de la especificidad de unión y la proporción de unión,» ¿cómo se distingue del no específico?
«Validación de IC50 y EC50 en hit to lead,» ¿se refiere a la optimización después de la criba?
«Medición de la velocidad de reacción enzimática,» ¿enzima? ¿Se puede medir eso?
En realidad, ¿no se puede saber cómo se mide? ¿No se pueden descargar manuales?
De todas formas, preguntaré al fabricante.»
Parece que Nakamura está bastante interesado en los microcalorímetros.
Parece que está tratando de hacerlo solo, pero surgen problemas que no puede resolver con la información del sitio web o los manuales.
A partir de ahora, cada mes presentaremos cómo Nakamura se convierte en un maestro del calorímetro.
Planeamos ofrecerles Q&A y resolución de problemas útiles para principiantes e intermedios en calorimetría.
¡Esperen con ansias!
También estamos publicando materiales técnicos relacionados. Por favor descárguelos y úselos.
Al completar la información necesaria en el formulario, podrá descargar el siguiente conjunto de materiales.
Nota de aplicación de ITC
Nota de aplicación de DSC
- Estudio de la estabilidad de la región Fab del anticuerpo para el desarrollo biofarmacéutico utilizando DSC
- Calorimetría de barrido diferencial como herramienta para el desarrollo rápido y eficiente de procesos biofarmacéuticos
- Fomento del desarrollo de formulaciones líquidas de biofarmacéuticos mediante calorimetría de barrido diferencial
- Estudios de preformulación y estabilidad de biofarmacéuticos usando DSC
Introducción de la profesora Harumi Fukada
Investigadora visitante de la Universidad Prefectural de Osaka
【Breve biografía】
1974 Graduada del Departamento de Química Agrícola de la Facultad de Agricultura de la Universidad Prefectural de Osaka
1979 Abandonó el curso de doctorado de la Facultad de Agricultura de la Universidad Prefectural de Osaka sin obtener el grado
Ese mismo año se convirtió en asistente de la Facultad de Agricultura de la Universidad Prefectural de Osaka
1997 Profesora asociada de la Facultad de Agricultura de la Universidad Prefectural de Osaka
2008 Profesora asociada de la Facultad de Ciencias Ambientales y de la Vida en la Escuela de Posgrado de la Universidad Prefectural de Osaka
2015 Se retiró
Postdocto del blog
La profesora Fukada ha estado trabajando en la creación de un sistema de calorimetría desde los primeros días cuando la calorimetría bioquímica no era tan conocida en Japón, bajo la tutoría del profesor Katsutada Takahashi en la Facultad de Agricultura de la Universidad Prefectural de Osaka. En los primeros días, utilizaban calorímetros de tipo Dewar y de flujo, consumiendo decenas de mg de proteína en una sola medición. Además, parece que su laboratorio fue el primero en Japón en realizar mediciones bioquímicas de proteínas con calorímetros. Hasta ahora, ha usado casi todos los modelos antiguos de DSC e ITC, incluidos los primeros DSC para soluciones de proteínas desarrollado por Privalov. El profesor Takahashi, aun superando los 60 años, sigue investigando sobre la medición del calor generado por microorganismos en el Kansai Science City como parte de un trabajo encargado por JST, y está desarrollando nuevos «dispositivos de medición de actividad biológica».
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