Consejos y Trucos para Nanopartículas

Caracterización de Nanopartículas

Hace unos días organizamos un seminario web en vivo titulado «Caracterización del Tamaño de Nanopartículas: Consejos y Trucos con el Zetasizer Nano«. Parece que este ha sido un tema de interés para muchos de ustedes, ya que, con disculpas, no tuve oportunidad de responder a todas las preguntas al final de la presentación. Así que aquí está mi seguimiento del evento.

Para resumir, este resumen se publicó antes del evento: Las nanopartículas se definen por su tamaño. En esta presentación se comparan diferentes técnicas de dimensionamiento, con un enfoque en consejos y trucos experimentales para obtener el máximo valor de técnicas de dimensionamiento como la dispersión de luz dinámica (DLS) con el Malvern Zetasizer. Algunas de las preguntas abordadas incluirán:

• ¿Cuáles son las ventajas, dónde están los límites?
• ¿Necesitas una distribución de intensidad o de número?
• ¿Qué índice de refracción elegir para las partículas?

Después de abordar brevemente la definición de una nanopartícula y un desvío sobre la microscopía electrónica (TEM, SEM) así como la dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS), el enfoque se dirigió al análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) en comparación con la dispersión de luz dinámica (DLS). En esencia, DLS proporciona excelentes estadísticas de conjunto para un tamaño promedio (por intensidad), un índice de polidispersidad promedio, y una distribución con picos moderadamente resueltos mediante inversión matemática. Por otro lado, NTA provee seguimiento de partículas individuales para una distribución por número altamente resuelta en picos, combinada con una razonable determinación de concentración. ¿Cuál distribución es mejor? Depende, ambas pueden ser correctas. Continuando sólo con DLS, una ventaja es que la distribución por intensidad siempre es correcta (siempre que los datos sean de calidad decente) independientemente del índice de refracción del material. Esto solo tiene importancia cuando se derivan distribuciones de volumen o número de los datos de intensidad, pero incluso entonces para nanopartículas verdaderas esto importará muy poco.

Los consejos iban desde cómo obtener acceso al curso de e-learning del Zetasizer, hasta cómo crear espacios de trabajo personalizados. Haga clic aquí para reproducir la grabación del seminario web si se lo perdió.

P: Si tengo una mezcla de micelas y liposomas, con DLS, ¿qué método de medición dará una verdadera reflexión de la distribución de tamaño? ¿Intensidad, volumen o número? ¿Cuál es la ventaja y desventaja de cada uno? ¡Gracias!
R: Si tienes pequeñas micelas y liposomas más grandes, entonces la distribución por intensidad mostrará una mayor contribución de los liposomas (por intensidad de dispersión), mientras que la distribución por número mostrará una mayor contribución de las micelas (por número). Estos resultados son correctos. Las distribuciones por número enfatizan las especies con el mayor número de partículas (que a menudo tienden a ser las más pequeñas). Las distribuciones por intensidad enfatizan las especies con la mayor intensidad de dispersión que contribuyen al resultado general (que a menudo tienden a ser las partículas más grandes). Si estás tratando de hacer muestras muy limpias sin ningún agregado grande, utiliza la distribución por intensidad, que por cierto es el método preferido para DLS en cualquier caso. Si estás tratando de ver principalmente las nanopartículas más pequeñas en tu preparación, prueba la distribución por número (siempre que los resultados de DLS sean de buena calidad de datos).

P: ¿Se puede obtener información útil sobre exosomas por DLS si no hay disponible un instrumento para NTA? Por intensidad de pico, tenemos vesículas más grandes, pero por volumen de pico, la mayoría son <100 nm. Parece que el reporte de intensidad de pico es más común.
R: Si tu muestra está «lo suficientemente limpia» (es decir, no contiene grandes residuos celulares, etc.) y hay suficientes exosomas (para que haya suficiente intensidad de dispersión) entonces DLS puede proporcionar información. Existen algunas publicaciones sobre esto. Sí, por volumen la media de pico a menudo será menor (ver publicación en el blog) – y el número incluso puede ser menor. NTA detecta una distribución por número. La intensidad de pico es más común para DLS, porque es la distribución más cercana a lo que se mide (es decir, la intensidad de las partículas dispersoras).

P: Al medir con dispersión hacia adelante o hacia atrás en la misma muestra, se observa un dimensionamiento completamente diferente. ¿Puedes explicar esto?
R: Para nanopartículas muy pequeñas el perfil de dispersión es isotrópico, lo que significa que la misma cantidad de luz se dispersa en todas las direcciones. Para partículas más grandes, el perfil de dispersión cambiará incluso mostrando máximos y mínimos en ciertos ángulos (como se muestra en la foto de la izquierda). En general, las partículas más grandes dispersan relativamente mucha más luz en ángulos hacia adelante. Si ahora se comparan los datos entre ángulos hacia adelante y hacia atrás, entonces es posible que los datos del ángulo hacia adelante contengan más señales de cualquier partícula más grande presente en la muestra. En otras palabras, por intensidad, el tamaño promedio en dispersión hacia adelante es más grande que el tamaño promedio en dispersión hacia atrás. Siempre que la calidad de los datos sea decente y las propiedades del índice de refracción sean conocidas, los resultados de intensidad cuando se convierten a una distribución de volumen deberían ser muy cercanos nuevamente. Así que sí, es totalmente esperado que los resultados por intensidad de diferentes ángulos de dispersión sean diferentes.

P: ¿Cómo podemos medir el tamaño de materiales cuyo índice de refracción y absorción no conocemos?
R: Si se espera que las partículas sean nanopartículas, entonces puede que no importe en absoluto, ver la discusión anterior sobre qué índice de refracción elegir. Para partículas más grandes, la distribución por intensidad todavía es correcta, sólo cuando se calcula la distribución de volumen o número entonces el conocimiento del índice de refracción es importante. Se pueden realizar mediciones de DLS e interpretarlas sin índice de refracción y absorción del material. Y esta es una distinción con respecto a la difracción láser para la cual estos parámetros normalmente son necesarios. Como nota al margen, puede contactar con nuestro servicio de asistencia si no encuentra propiedades del material; pueden tener los valores de mediciones previas en muestras similares.

P: ¿Qué tal medir el tamaño de polímeros termoresponsivos?
R: Sí, esto funciona muy bien con DLS. Los polímeros termoresponsivos como PNIPAM se han utilizado para DLS. En particular, se pueden realizar mediciones de tamaño en función de la temperatura de manera automatizada durante la noche con el software Zetasizer. Si hay diferentes tamaños presentes, estos pueden o no ser resueltos como picos separados, si se necesita mayor resolución se puede considerar una técnica de separación como la cromatografía de permeación en gel junto con la dispersión de luz.

P: ¿Es confiable el DLS para muestras con tamaño de 200 nm?
R: Sí, DLS es muy confiable para partículas de 200 nm. DLS puede funcionar muy bien hasta unos pocos micrones (si no hay sedimentación y hay suficientes partículas en el volumen dispersante). El amplio rango de aplicación para DLS está en el rango de 1 nm a 1 micrón, que es el rango de mejor rendimiento de dispersión de luz dinámica. Se listado un rango de estándares de látex medidos con DLS en esta nota técnica.

P: Estábamos pensando en usar Tritón al ~0,5% como dispersante para nanopartículas de TiO2 de ~70 nm de tamaño. Según su experiencia, ¿el Tritón causaría problemas durante las mediciones de DLS?
R: Se puede usar Tritón, y probablemente no causará problemas. Sin embargo, es buena idea medir Tritón en la concentración que desea usar por sí mismo. Puede formar micelas en forma de gusano y distorsionar los resultados. Sus muestras de TiO2 pueden, por otro lado, mostrar tantas señales de dispersión que esto podría abrumar cualquier señal de Tritón. Puede encontrar este artículo sobre TiO2 útil.

P: Mis resultados de Zetasizer a menudo dicen que nuestras partículas son de alrededor de 10 nm. Nos gustaría saber más sobre las partículas, pero no parece que otros dispositivos de Malvern puedan dar información sobre partículas tan pequeñas. ¿Alguna sugerencia?
R: Eso suena como un buen problema para tener; muchos investigadores están preocupados por intentar evitar partículas grandes y encontrar formas de hacerlas más pequeñas. Aunque no ofrecemos TEM, SEM o AFM, existe una técnica que podría proporcionar información adicional sobre sus partículas: el Viscosizer puede medir directamente un tamaño ponderado por volumen, y la viscosidad intrínseca puede proporcionar información sobre la estructura de sus partículas si resultan ser poliméricas/no esféricas.

P: ¿Puede comentarme sobre tiempo de ejecución (¿cuánto debería durar?) y número de corridas (reproducibilidad)?
R: El software tiene un modo automático. En esta configuración, adquirirá suficientes fotones para dar un resultado estadísticamente relevante. Si desea establecer valores manualmente, apunte a acumular al menos 1 millón de fotones. Para verificar cuán reproducibles son los valores, el mínimo absoluto sería tres, sin embargo, la mayoría de los investigadores realizarán más corridas para aumentar la confianza. Es posible hacer muchas corridas más cortas, y esto puede ser útil cuando un proceso cambiante debe observarse. Aquí, se acepta la fluctuación inherente en las mediciones cortas para poder seguir una tendencia general a lo largo del tiempo. Este sería un buen uso del modo manual, pero en la mayoría de los otros casos, el modo automático evita cualquier configuración incorrecta.

P: Al medir el tamaño de partículas, ¿cuál es un valor pdI apropiado o depende del muestra?
R: Esto depende de la muestra, y puede haber datos con pdI bastante grandes que todavía sean apropiados. Para estándares de látex monodispersos, se pueden ver valores tan bajos como pdI = 0.03 en los datos.

P: ¿Pequeñas burbujas de aire en la muestra importan en la medición de DLS?
R: Sí, pueden importar. Si es solo un pico ocasional muy pequeño, esto no es una preocupación y al final será promediado. Los picos consistentes pueden llevar a un pico en tamaño grande de hasta unos pocos micrones o más, y esto también será señalado como un comentario en el informe de calidad de tamaño de los datos. La mejor manera de evitar esto puede ser una pequeña centrifugación en un microscopio de mesa.

P: ¿Cómo se determina el tamaño cuando el tamaño promedio en el informe difiere de la distribución de pico en el espectro?
R: Esto fue discutido en una publicación anterior sobre el z-promedio del tamaño de pico. También menciona el caso donde el promedio puede ser menor/en medio/mayor que los picos.

P: Hablando de cuentas por segundo, ¿cuál es una cuenta ideal para observar?
R: El fotodiodo de avalancha (APD) dentro del Zetasizer es un detector de luz muy sensible. Si recibe demasiada luz, podría dañarse. También se volverá no lineal a tasas de conteo muy altas. Las tasas de conteo recomendadas para mediciones DLS son de 100 a 500 kilo cuentas por segundo kpcs. En el modo automático, el software ajustará automáticamente la intensidad del láser para alcanzar una intensidad de dispersión adecuada de la muestra.

P: ¿Se recomienda usar tamaños más grandes de 100 nm en el Malvern Zetasizer Nano, funcionan?
R: ¡Sí! Las partículas mayores de 100 nm pueden medirse fácilmente con el Zetasizer. De hecho, hasta unos pocos micrones es el rango estándar para DLS. Hemos podido medir partículas de hasta 10 micrones, aunque la sedimentación puede ser una preocupación para estos objetos muy grandes. DLS brilla en el rango nanómetro a micrón. Se muestra una gama de diversos estándares de Látex medidos con DLS en esta nota técnica. Solo para aclaración y evitar dudas: DLS funciona bien por debajo y por encima de 100 nm por lo que no se requiere tener partículas mayores de 100 nm.

P: ¿Las pequeñas burbujas de aire en la solución o el polvo dentro de las cubetas influyen en las mediciones de tamaño de DLS? Si es así, ¿qué resultados obtendremos? ¡Gracias!
R: Si las pequeñas burbujas de aire están sólo adheridas a la pared de la cubeta, entonces esto no debería ser una preocupación a menos que estén directamente en el camino del haz del láser o bloqueando las ópticas de detección. Esto se puede superar fácilmente golpeando la cubeta sobre la mesa e insertándola de nuevo (o como una medida más avanzada, usando solventes desgasificados). Si las burbujas de aire y/o el polvo se desprenden y flotan en la muestra, entonces sí, esto podría llevar a picos de tamaño grande en la distribución de tamaño y, en casos extremos, incluso hacer imposible medir sus nanopartículas. La dispersión de luz es muy sensible a la presencia de incluso pequeñas cantidades de dispersores grandes en la muestra. Sí, la limpieza definitivamente es un buen objetivo para DLS (incluso si la dispersión hacia atrás perdona más que las ópticas tradicionales de 90 grados).

P: ¿Qué tal para medición del tamaño de nanocopos?
R: Si los copos están en el rango submicrón, deberían funcionar. La mejor manera de averiguarlo es simplemente probarlos en un instrumento. Si no tienes acceso a uno, envíanos algunas muestras para un análisis de cortesía.

P: Para algunos de mis análisis los valores en modo de Intensidad son casi 2 veces más altos que en modo Número, ¿por qué y cuáles valores son correctos?
R: Si los resultados se obtienen de buenos datos (es decir, si el informe de calidad de datos de tamaño no tiene quejas) y si son repetibles, entonces esto es completamente posible. La razón es probablemente una distribución amplia, que por número siempre estaría aquilatada en una media más pequeña que su media por intensidad. Para una discusión más exhaustiva, consulte este blog sobre distribuciones de intensidad y número.

P: ¿Cómo correlacionas el radio de giro al radio hidrodinámico?
R: El radio de giro o Rg es un parámetro diferente que caracteriza una nanopartícula o molécula. Rg proviene de la dispersión estática observada como una función del ángulo; es el «radio de masa cuadrada media» efectivo. En muchos casos, este tamaño es más pequeño que el radio hidrodinámico Rh. Para objetos esféricos Rg = 0.78 * Rh, vea esta discusión sobre Rh vs Rg.

P: ¿Qué resultado se puede esperar obtener al analizar tolueno?
R: El tolueno es un hidrocarburo líquido [Mw= 92g/mol] que se usa como solvente que es comparativamente fácil de mantener limpio. Debido a su alto peso molecular (en comparación con el agua) es un buen dispersor, y esto lo convierte en un estándar perfecto para experimentos de dispersión de luz estática. Cuando se coloca en el Zetasizer, la intensidad de dispersión medida proporcionará una excelente medición de la sensibilidad general y del estado del sistema. Como control de calidad final, la tasa de conteo de tolueno de cada Zetasizer se registra antes de salir de la fábrica, por lo que al comparar con este número se puede evaluar si el sistema todavía funciona tan bien como cuando fue fabricado. Una tasa de conteo de tolueno típica para un sistema de dispersión hacia atrás debería estar por encima de 150 kcps, kilo cuentas por segundo. Una intensidad de tolueno reducida probablemente indique una potencia de láser reducida o un desalineamiento.
Para realizar una medición de tolueno, seleccione una medición de tamaño, cubeta de vidrio o cuarzo adecuada, y registre los ‘resultados parciales’, es decir, permita que los resultados se guarden conteniendo solo datos de correlación, vea la captura de pantalla a continuación. (Si hay alguna preocupación sobre los rasguños en las paredes de la cubeta, puede forzar la posición de medición al centro, Measurement-Advanced-Positioning Method-Centre of the cell(water clear samples only.)

P: ¿Qué es el vector de onda en DLS?
R: El vector de dispersión o vector de onda se determina mediante la ecuación
q = 4 * π * n * sin (θ/2) / λ
donde, por ejemplo, para una muestra en agua, el índice de refracción es n=1.33, el ángulo de dispersión hacia atrás es θ = 173° y la longitud de onda del láser es λ = 632.8nm en el Zetasizer Nano S.
Sustituyendo los valores en la ecuación encontramos q=0.026 1/nm para el vector de onda en el Zetasizer Nano S. Para dispersión hacia adelante a 13° q~0.003 1/nm y para 90° grados q~0.019 1/nm.

q = 4 * pi * n * sin(θ/2) / λ aproximadamente ≈ 0.026 1/nm para el Zetasizer Nano en dispersión hacia atrás.
P: ¿Es el Chi Cuadrado en DLS lo mismo que el error del ajuste acumulativo de la suma de cuadrados SOS?
R: No, el chi cuadrado y el error acumulativo de ajuste de la suma de cuadrados SOS no son lo mismo. El error de ajuste acumulativo es la suma de los cuadrados de la desviación entre los valores de la función de correlación medida M y los valores de correlación esperados del ajuste F.

donde la suma pasa por todos los «canales» ajustados de la función de correlación. Tenga en cuenta que esto no es necesariamente idéntico al número de canales de la función de correlación, ya que algunos canales iniciales (en tiempos de retraso pequeños, debido al ruido) y algunos canales posteriores (en tiempos de retraso más largos) pueden estar excluidos en el ajuste. Los canales de ajuste reales se muestran en el informe Cumulants Fit (M).

P: ¿Qué pasa con la caracterización de nanotubos? ¿Puede medirse con DLS?
R: Sí, se pueden medir cuando están dispersos. Para objetos de dispersión no esféricos, DLS proporcionará el coeficiente de difusión correcto. En la mayoría de los casos, los usuarios gustan de ver esto convertido a un tamaño, que sería el tamaño de una esfera equivalente moviéndose con el mismo coeficiente de difusión. Esto funcionará para el z-promedio, y si se conocen las dimensiones de una barra, es posible calcular el tamaño hidrodinámico esperado (a través del factor de forma de Perrin, vea por ejemplo FAQ Can you get shape information from DLS). Debido a la no esfericidad, el pdI o polidispersidad será más alto que el pdI de una muestra con solo esferas de tamaño equivalente. Esto se debe al hecho de que las barras se mueven más rápido a lo largo de un eje que el otro. En casos extremos, el algoritmo de distribución puede incluso mostrar dos picos: uno que corresponde aproximadamente al menor diámetro de barra, y el otro a un tamaño esférico general equivalente. También puede interesarle el póster «Determination of the Aspect Ratio of Metal Colloid Disks from Dual Angle DLS Measurements».

P: ¿Qué pasa con las mediciones de potencial Zeta de Nanotubos, también hay un error?
R: Sí, se puede medir el potencial zeta de nanopartículas. Para los Nanotubos esto puede ser un poco más complicado si están suspendidos en un medio de baja constante dieléctrica. La forma en sí misma no es un obstáculo para la dispersión de luz electroforética, aunque puede llevar a una distribución ligeramente más amplia que desde partículas esféricas equivalentes.

P: ¿Hay alguna forma de mostrar el Material en una página de informe? El defecto es mostrar el nombre de muestra, pero no el material.
R: Sí, es posible mostrar cualquier parámetro en una página de informe; más específicamente, el material puede ser añadido al informe. Esto se hace en el Diseñador de Informes (ayuda está en el manual, Herramientas-Diseñador de Informes) abriendo una copia del informe que desea editar. Guárdelo bajo un nuevo nombre. Luego añada el parámetro que está listado bajo SOP Material – Nombre de Material. Los informes tienen vistas de pantalla e impresión, por lo que esto tiene que ser copiado en ambas versiones. Revise el manual o pida ayuda al servicio de atención.

P: Para el análisis de QC, ¿qué es mejor – Nanotracking o DLS? Porque para propósitos investigativos basados en nanopartículas, estoy más familiarizado con el uso de NTA o SEM.
R: Para el análisis de QC, DLS es la solución más común. Más específicamente, el tamaño promedio o el tamaño z-promedio y el índice de polidispersidad general se utilizan para las mediciones de tipo control de calidad/consistencia de datos. DLS acumula la señal de dispersión de una cantidad mucho mayor de partículas que NTA, y por lo tanto se presta a proporcionar resultados estadísticamente fiables en un tiempo mucho más corto.

P: ¿Qué índice de refracción se utiliza generalmente para el análisis de nanopartículas de fullereno?
R: Para z-promedio, pdI y distribución de intensidad no se necesita ningún índice de refracción de absorción. Sí, el software lo solicitará, pero esto es solo para que una distribución de volumen y número pueda ser calculada a partir de él. Si se requieren esas dos distribuciones derivadas, entonces los valores solo importarían cuando el tamaño es mayor de 100 nm (ver discusión previa sobre qué índice de refracción elegir).

P: Hola, ¿cómo puedes tratar las nanopartículas que se agregan durante las mediciones?
R: Si las partículas se están agregando durante la medición, lo mejor sería realizar mediciones individuales manuales, con una duración más corta (intente 5 segundos) y observar la tendencia en estos. Habrá alguna variación estadística en el resultado, pero debería ser posible deducir el tamaño promedio y su comportamiento de crecimiento de los cambios de tamaño observados. Si la muestra es altamente inestable y se agrega demasiado rápido, pruebe una preparación diferente, sonicación, pH, aditivos, surfactant, centrifugación, filtrado; pero en esencia, la dispersión de luz te está diciendo: esta muestra prefiere formar agregados en lugar de estar dispersa en solución.

P: ¿Dónde puedo encontrar el manual para redactar un SOP, para una muestra particular?
R: Este era uno de los consejos: el manual está instalado en la computadora en pdf. Vaya a Inicio – Programas – Malvern Instruments – Zetasizer Software – Manuales y abra el Manual del Usuario del Zetasizer Nano. Busque en el pdf con Ctrl-F o vaya directamente al capítulo 3 – Realización de una medición SOP.

P: ¿Cuánto volumen de muestra se requiere en Zetasizer Nano?
R: Esto depende del modelo. Para el Zetasizer microV es 2 µL, para la serie Zetasizer Nano 12 µL, y para el automatizado Zetasizer APS 20 µL.

P: ¿Por qué al medir un solvente, como PBS, por sí solo proporciona datos que sugieren la presencia de partículas?
R: El PBS por sí solo no debería contener partículas. Lo que puede suceder es que habrá picos ocasionales aleatorios que pueden parecer una distribución de tamaño, pero al verificar el informe de calidad de tamaño indicará claramente el mensaje de que estos no son datos de DLS fiables. En otras palabras, las estadísticas de cualquier tamaño obtenido realmente no son una medida confiable del tamaño. Si no hay tal mensaje de error y hay una función de correlación real, entonces simplemente puede haber partículas en el buffer. Verifique el agua por sí misma, filtre el buffer, la tasa de conteo de la muestra debe ser ~50 kcps, definitivamente por debajo de 100 kcps. Si es mucho más alta, entonces las partículas son reales y se deben a la muestra (es decir, en el buffer) o la cubeta. Sin embargo, lo más probable es que la función de correlación muestre saltos intermitentes y, en general, una línea plana, en cuyo caso el «tamaño» observado es realmente solo ruido.

P: En cuanto a los nanotubos, ¿también podrías ver potencialmente un pico debido a la difusión rotacional?
R: Sí, existe la posibilidad de que eso suceda. Sin embargo, lo más probable es que el pico de tamaño más pequeño se deba al menor diámetro de los tubos. Como comentario al margen, algunas nanopartículas de oro coloidal pueden mostrar un pico de tamaño pequeño artificial debido a la rotación. Algunos detalles también se discuten en el documento Rotational Diffusion and Results From DLS Measurements de Malvern.

P: ¿Qué pasa con la medición del potencial Zeta de nanotubos, también hay un error?
R: La medición del potencial zeta o movilidad electroforética es típicamente independiente del tamaño, y no debería haber error introducido, excepto por el hecho de que el parámetro de desviación del zeta puede aumentar sobre el de esferas monodispersas cargadas de manera similar.

P: El tolueno no es un coloide por sí mismo, entonces, ¿por qué dispersa la luz?
R: El tolueno consiste en moléculas que tienen una polarizabilidad. Estas moléculas dispersarán la luz, solo un poco, pero lo suficiente para detectar. El agua también dispersa la luz (pero menos, porque su peso molecular es menor.) Como analogía, por eso el cielo es azul: dispersión de pequeñas moléculas de aire en la atmósfera.

P: El tamaño de la intensidad y el pdI generalmente cambian con la tasa de conteo, ¿cómo determines la tasa de cuenta correcta para tus partículas?
R: En nuestra experiencia, es bastante inusual ver que el tamaño y pdI cambien con la tasa de conteo. La razón de un cambio aparente podría ser que el detector está operando más allá de su rango lineal. Si la tasa de cuentas del detector está, por ejemplo, más allá de 1000 kcps, entonces esto influirá en la función de correlación porque el APD no puede seguir el ritmo de todos los fotones. Si se opera en modo automático, esta situación no debería ocurrir, ya que el software apuntará a mantener la tasa de cuentas entre 100-500 kcps.

P: Soy nuevo en el instrumento Zetasizer. Realicé una prueba con el Estándar de Transferencia de Potencial Zeta para asegurarme de que nuestro resultado corresponde con el rango en la etiqueta del estándar. Pero no sé a dónde ir en el software para ver el resultado (y enviarlo, si quiero) cuando termino de realizar la prueba
R: El mejor punto de partida puede ser la Guía de Inicio Rápido, disponible en su computadora en Inicio – Todos los Programas – Malvern Instruments – Zetasizer – Manuales – Guía de Inicio Rápido de Zetasizer. Este es un documento pdf, que en la parte 3 «Realización de Otras Mediciones – Introducción» explica cómo ver el resultado recién obtenido. En resumen, vaya a la vista de registros de resumen (esta es la predeterminada) y seleccione la pestaña de informe PSD de Intensidad (M) para ver los números clave para su medición. Si esto todavía no tiene sentido, envíe el archivo de datos a nosotros, y lo guiaremos a través de él. También parece que el curso de e-learning Zetasizer sería perfecto, donde se introducen estos conceptos en detalle. Contactar al servicio de asistencia para el acceso.

P: ¿Qué tal los nanoprisms usando el DLS? Porque entiendo que es solo para nanoesferas
R: DLS puede funcionar con cualquier material de forma que difunda. En la dispersión de luz dinámica, se obtiene el coeficiente de difusión traslacional observando las fluctuaciones de intensidad de una muestra. Si esos nanoprisms están en solución y difunden, entonces el Zetasizer debería ser capaz de proporcionarle el coeficiente de difusión, y también calculará el tamaño de una esfera hipotética que se movería con ese mismo coeficiente de difusión. Así que esto debería funcionar en general, a menos que la muestra esté tan agregada que solo grandes aglomerados (y ninguna de las nanopartículas más pequeñas) están apareciendo en la señal de dispersión. No hay daño en colocar una cubeta con su muestra en el sistema y ver qué encuentra DLS. Pruébalo, y si hay problemas con la interpretación de los datos, contáctenos.

P: ¿Es DLS adecuado para medir puntos cuánticos?
R: Sí, DLS puede usarse para determinar el tamaño de los puntos cuánticos. Por favor, eche un vistazo a esta nota de aplicación que muestra datos de tanto DLS como ELS en muestras de puntos cuánticos. La única posible complicación para DLS podría ser la fluorescencia que se mostraría como un intercepto muy pequeño en la función de correlación (y también entonces sería señalado en el informe de calidad de tamaño). En casos donde la luz fluorescente incoherente interfiere, se puede agregar un filtro de banda estrecha opcional al sistema para superar el efecto. Para una descripción general de DLS hay un documento blanco titulado «Aplicación de la Dispersión de Luz Dinámica (DLS) a Formulaciones Terapéuticas de Proteínas: Principios, Mediciones y Análisis – 4. Preguntas Frecuentes» con detalles útiles.

P: ¿Cuánto más grande es el diámetro hidrodinámico en comparación con el diámetro «en seco»?
R: Esto es bastante complicado de responder. Para nanopartículas sólidas puede ser realmente cercano, para partículas con capas de cáscara poliméricas, o aquellas con capas de estabilización estérica, puede ser varios nanómetros. Solo para su información adicional, también tenga en cuenta que el «diámetro seco» probablemente se obtuvo con una técnica que proporciona la distribución numérica y por lo tanto puede parecer artificialmente sesgado hacia tamaños más pequeños cuando se compara directamente con datos de DLS de intensidad, por lo que tenga cuidado al comparar distribución numérica con distribución numérica.

P: ¿Puede comentar sobre la técnica 4F+MALLS? ¿Es más precisa?
R: Cuando se combina la dispersión de luz con una técnica de separaciones como la fraccionación por flujo de campo, la resolución de la distribución obtenida será mejorada sobre solo usar dispersión de luz sola. MALLS proporcionará un peso molecular promedio general de la muestra en el volumen de detección. MALLS por sí mismo solo proporcionará un peso molecular promedio (y Rg) por lo que a menudo se combina con una técnica de separaciones como FFF o GPC o SEC. DLS por sí mismo proporcionará tanto un tamaño promedio general como una distribución, sin embargo, la resolución de esa distribución no es perfecta. Combinar una técnica de separaciones con DLS mejorará así también la resolución sobre el DLS normal en lotes. La 4F dará la resolución más alta, pero para medir la distribución se necesitan 4F+MALLS o 4F+DLS – y las dos técnicas miden diferentes parámetros: MALLS es para peso molecular, DLS es para tamaño hidrodinámico.

P: Cuando haces la titulación de DLS, ¿es mejor seguir la intensidad (kcps) vs pH o Z-Ave vs pH?
R: La buena noticia es que ambos parámetros se registran durante la corrida, por lo que se pueden obtener con una titulación y no hay necesidad de repetir la medición. Ambos parámetros pueden ser útiles y te dicen cosas ligeramente diferentes. Por ejemplo, si la intensidad de dispersión aumenta esto podría potencialmente ser debido a dos rutas diferentes: ya sea agregación o un aumento en la presencia de partículas existentes. Al observar el z-promedio, uno puede acercarse a la respuesta de este rompecabezas: si el tamaño aumenta –> es agregación. Si el tamaño permanece constante –> de alguna manera el proceso está aumentando el número de partículas (o cambiando significativamente las características de dispersión de las partículas existentes). Así que la intensidad es el resultado de tanto la concentración como del tamaño de las partículas, mientras que DLS se enfocará solo en el tamaño.

P: ¿Qué tan críticos son los límites de concentración de nanopartículas sobre la calidad de los resultados?
R: Si las nanopartículas no están interactuando, entonces la concentración no debería importar en absoluto. En algún punto de alta concentración, puede entrar en juego un efecto llamado dispersión múltiple, sin embargo, esto se minimiza en ópticas de dispersión hacia atrás. En algún punto de baja concentración, no habrá suficiente señal en absoluto para detectar la dispersión de las nanopartículas más allá del ruido aleatorio del solvente. La teoría para interpretar los datos de DLS se construye bajo la suposición de dilución infinita, por lo que si tiene dudas, realice una serie de mediciones por dilución y verifique que el tamaño no cambie, como mínimo debería haber un comportamiento asintótico en baja concentración.

P: Dado que la definición de la UE de nanomateriales se define como distribución de números de partículas por debajo de 100 nm, ¿cree que la conversión matemática de intensidad a número es aceptable para clasificar el nanomaterial? ¿O es necesario usar otros métodos, como NTA o SEM para tener la frecuencia en números?
R: La recomendación de política de la UE indica que la distribución numérica es un parámetro clave y un nanomaterial típico tendría más del 50% de partículas por número por debajo de 100 nm. DLS mide nativamente intensidad, la cual puede convertirse en número. Sin embargo, puede haber situaciones donde la intensidad de partículas más grandes ensombrece la señal de nanopartículas más pequeñas: Si DLS (y la distribución numérica derivada de ésta) muestra la presencia de nanomaterial de acuerdo con la definición (es decir, más del 50%) entonces esto debería ser evidencia de apoyo. Sin embargo, si DLS (y la distribución numérica derivada de ésta) no muestra la presencia de nanomaterial de acuerdo con la definición, entonces esto no es evidencia suficiente de que no hay nanomaterial presente. Para demostrar la ausencia de nanomaterial, una técnica basada en números como NTA sería mejor. Hay un seminario web grabado revisando la legislación sobre nanomateriales y métodos de caracterización para enfrentar estos desafíos.

P: ¿Qué precisión tiene el PSD de Volumen para coloides de material negro como metal u óxido de hierro, y qué tan importante es conocer cuál es el RI del material y la absorción?
R: Si se conocen las propiedades del índice de refracción, entonces la distribución de volumen debería ser bastante precisa. Repite la medición varias veces para observar cuán robusta es la distribución de volumen en las diferentes mediciones. Si los coloides están mayormente por debajo de 100 nm, entonces el índice de refracción puede no tener tanta influencia como se podría pensar. El método más simple para comprobarlo es editar un archivo de datos y probar un conjunto de valores de índice de refracción y absorción para observar el efecto que esto tiene sobre la distribución de volumen calculada.
Ocasionalmente, el algoritmo de posicionamiento automático en dispersión hacia atrás puede «confundirse» por la presencia de absorción. [Esto se debe al hecho de que una menor intensidad de dispersión se debe a una contribución de dispersión múltiple o una contribución de absorción. El caso típico es la dispersión múltiple, por lo que el algoritmo piensa que hay dispersión múltiple presente en la muestra y entonces optimiza cerca de la pared del celda. Puede comprobar esto haciendo mediciones individuales repetidas y observar la posición de medición. Si la posición está cerca de la pared y varía, por ejemplo, entre 0.65 mm/0.85 mm/1.25 mm sin tendencia, el algoritmo de posicionamiento puede no manejar correctamente esta muestra absorbente.] En tales casos, aún puede obtener resultados confiables diluyendo su muestra, forzando la medición a una posición de medición fija (es decir, el centro) o haciendo ambas cosas.

P: ¿Alguna vez has determinado el tamaño de subpartículas en plasma?
R: Si el plasma está algo limpiado de desechos celulares grandes, entonces puede ser posible obtener información sobre partículas más pequeñas. Sin embargo, hay una variedad de componentes diferentes en el plasma que hacen que sea bastante difícil identificar contribuciones específicas. Una técnica basada en número como NTA permite etiquetar fluorescente de subsecciones específicas, y esto podría ser el enfoque más específico. Sería posible simplemente colocar una muestra en el Zetasizer para intentar con su preparación de plasma, en modo automático, el software hará su mejor esfuerzo para medir (pero simplemente puede ser demasiado amplio y no adecuado para DLS).

P: ¿A qué se refiere la absorción de partículas en las propiedades del material?
R: La absorción es la parte imaginaria del índice de refracción complejo. Para muchos materiales este parámetro es insignificante y algunos valores están listados en esta tabla de valores de índices de refracción de nanomateriales.

P: ¿Puedes explicar por qué un resultado que muestra un pico puede tener un promedio de pico diferente al promedio general?
R: Sí, esto puede suceder porque se utilizan diferentes algoritmos de ajuste en los dos ajustes. Más a menudo, el promedio general será ligeramente más pequeño debido a que el ajuste z-promedio general está definido por un estándar ISO para incluir más del decaimiento inicial de la función de correlación. Sin embargo, también pueden ocurrir otros casos y podría encontrarse útil mirar la explicación detallada.

P: Suponiendo una muestra monodispersa, ¿esperaría alguna vez ver z-promedios diferentes al comparar intensidad vs número vs distribución de masa?
R: No. El z-promedio se obtiene del análisis de la intensidad de dispersión y solo se define para intensidad. Al comparar el z-promedio en los informes de Malvern, solo encontrará el verdadero z-promedio en los informes de distribución de intensidad, volumen y número. Estos deberían ser exactamente el mismo valor en los diferentes informes del mismo registro. Solo para aclaración, si su pregunta era sobre valores medios de pico, como en: «Suponiendo una muestra monodispersa, ¿esperaría alguna vez ver medios de ancho de pico diferentes al comparar intensidad vs número vs distribución de masa?» entonces la respuesta es sí. El medio del pico será diferente para las diferentes distribuciones.

Recursos adicionales

• Solicitar una demostración de DLS en su sitio
• Descargar la última actualización del software de la familia Zetasizer
• Reproducir el seminario web: Caracterización del tamaño de nanopartículas: Consejos y Trucos

Anteriormente

• FAQ: tamaño de pico o z-promedio – ¿cuál elegir en DLS?
• Cromatografía de Exclusión de Tamaño (SEC): cuándo usar MALS
• ¿Cuál tamaño es correcto: distribuciones de intensidad, volumen, número

Si tiene alguna pregunta, por favor envíeme un correo electrónico a ulf.nobbmann@malvern.com. ¡Gracias!

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