¿Qué detector de dispersión de luz es mejor para mí?

Determinar qué sistema de gel permeación/cromatografía de exclusión por tamaño (GPC/SEC) es mejor para tus necesidades puede ser una tarea desalentadora. Incluso después de haber decidido incluir un detector de dispersión de luz para obtener datos de peso molecular absoluto, todavía te quedan dos opciones: un detector de dispersión de luz multiángulo (MALS) o un detector de dispersión de luz de ángulo recto y ángulo bajo (RALS/LALS). Ambas configuraciones de dispersión de luz proporcionarán el peso molecular absoluto de una muestra pero utilizan diferentes enfoques para ese objetivo común. Afortunadamente, Malvern Panalytical ofrece ambos; la unidad modular SEC-MALS 20 que puede conectarse a OMNISEC, el TDAmax, u otros sistemas de terceros, y un detector RALS/LALS integrado en los sistemas GPC/SEC todo incluido OMNISEC y TDAmax. En este post, discutiré los detectores MALS y RALS/LALS y, con suerte, proporcionaré la información relevante que te permita determinar cuál configuración es mejor para ti y tu aplicación.

Para empezar, daremos un paso atrás y discutiremos brevemente algo de la teoría de dispersión de luz (para una discusión más detallada sobre la dispersión de luz estática, por favor, consulta nuestro informe técnico publicado anteriormente sobre el tema). La razón por la cual los detectores de dispersión de luz funcionan es porque la intensidad de la luz dispersada por una molécula es directamente proporcional a su peso molecular. Cuanto mayor es el peso molecular, mayor es la intensidad de la luz dispersada. Esta relación se destaca mediante la ecuación de Rayleigh, que se muestra a continuación, donde RΘ representa la intensidad de la luz dispersada en un ángulo dado Θ y Mw es el peso molecular de una muestra.

Además, el ángulo de observación de la luz dispersada juega un papel importante. Las muestras relativamente pequeñas con un radio de 10-15 nm o menores son conocidas como dispersores isotrópicos, lo que significa que dispersan la luz de la misma manera en todas las direcciones. Esto significa que la intensidad de la luz observada en el detector de 90° es la misma que la intensidad de la luz observada en un detector colocado a 15°, 45°, 135°, etc. Las muestras más grandes que ese rango de 10-15 nm se ven afectadas por interferencias, ya que la muestra es lo suficientemente grande como para dispersar la luz varias veces antes de que llegue al detector. El resultado es que la intensidad de la luz dispersada para muestras grandes varía dependiendo del ángulo de observación. La dependencia angular de la intensidad de la luz dispersada significa que se podrían calcular diferentes pesos moleculares en función de la colocación del detector. Para minimizar los efectos de interferencia, el ángulo de observación óptimo para la intensidad de la luz dispersada de muestras grandes es el ángulo de 0°. Desde un punto de vista práctico, esto es imposible, ya que el detector no podría discernir entre la luz dispersada por la muestra y la luz del haz incidente. Las soluciones a este problema, observar la intensidad de la luz dispersada en el ángulo de 0°, están representadas por las configuraciones de detectores MALS y RALS/LALS.

Un detector MALS típicamente emplea entre tres y veinte detectores dispuestos en varios ángulos alrededor de la celda de flujo de la muestra. Generalmente se incluye un detector de 90°, y los detectores restantes pueden variar desde tan bajos como 12° hasta tan altos como 168°. Un detector MALS realiza mediciones de la luz dispersada en una variedad de ángulos, ajusta los datos a un modelo y extrapola hacia atrás a 0° para determinar el peso molecular de la muestra. Si la muestra es un dispersor isotrópico, entonces cada punto de datos representará la misma intensidad de dispersión y la extrapolación hacia atrás a 0° será una línea plana. Si la muestra es lo suficientemente grande como para mostrar dependencia angular, las diferencias en la intensidad de la luz dispersada en función del ángulo de observación se harán evidentes. Ambos ejemplos se muestran en las parcelas de Zimm parciales a continuación.

Parcelas de Zimm parciales que muestran varios ángulos de una respuesta MALS; Izquierda: una muestra que muestra dispersión isotrópica con la misma intensidad en todos los ángulos; Derecha: una muestra que muestra dependencia angular, como se evidencia por la pendiente de la gráfica

El arreglo del detector RALS/LALS se compone de detectores de 90° y 7° elegidos juiciosamente por su naturaleza complementaria. Para muestras de 10-15 nm de radio y más pequeñas, el detector de 90° es ideal porque está situado en un ángulo recto al haz incidente, lo que maximiza la relación señal/ruido. Dado que las muestras más pequeñas dispersan la luz con la misma intensidad en todas las direcciones, el detector RALS ofrece la respuesta ideal para una medición directa del peso molecular de una muestra. Para muestras con un radio mayor que ese rango de 10-15 nm que muestran dependencia angular, el detector LALS proporciona una medición en 7°, que es la posición más baja de un detector disponible. La colocación a 7° significa que el detector está esencialmente tomando una medición directa del peso molecular de la muestra y evita la necesidad de ajuste y extrapolación. Es importante notar que el detector LALS es preciso para muestras de todos los tamaños, sin embargo, debido a la menor intensidad de la luz dispersada proporcionada por muestras más pequeñas y de menor peso molecular, el RALS proporciona una señal más limpia debido a su colocación ortogonal a la fuente de luz incidente.

Parcelas de Zimm parciales que muestran la medición directa del peso molecular; Izquierda: la respuesta RALS de 90° para la medición de una muestra que muestra dispersión isotrópica; Derecha: la respuesta LALS de 7° para la medición de una muestra que muestra dependencia angular

Para determinar el detector de dispersión de luz más adecuado para tus necesidades, tendrás que considerar tu aplicación, la información que estás buscando y tu preferencia personal. Tanto los detectores MALS como RALS/LALS tienen ventajas y desventajas que pueden hacerlos más adecuados para una situación u otra, pero la buena noticia es que ambos pueden contar con proporcionar resultados precisos.

Por ejemplo, si tu principal objetivo de análisis es una muestra relativamente grande de alto peso molecular, ambas configuraciones de detectores MALS y RALS/LALS están diseñadas para manejar todo el rango de pesos moleculares presentes en tu muestra. Sin embargo, si estás principalmente interesado en analizar materiales pequeños, de bajo peso molecular, entonces un detector RALS podrá manejar la mayoría de tus análisis. Tener un detector LALS complementario garantizará que cualquier fracción grande de tu muestra, o agregados potenciales, se observen con precisión, incluso si existen en baja concentración dentro de tu muestra. Un detector MALS puede determinar el peso molecular correcto, pero ya que todos los detectores observarán la misma intensidad de luz dispersada para las muestras pequeñas de dispersión isotrópica, obtener el mismo resultado repetidamente puede volverse redundante.

El ejemplo anterior es a menudo el caso para los científicos que estudian proteínas. Debido a la naturaleza ordenada de sus estructuras, las proteínas son moléculas relativamente densas, lo que significa que incluso las especies de alto peso molecular son comparativamente pequeñas. Incluso las proteínas con pesos moleculares tan altos como 700 kDa solo tienen un radio de 10-12 nm. El potencial para altos pesos moleculares pero tamaños moleculares relativamente pequeños significa que las proteínas son típicamente dispersores isotrópicos y son muestras ideales para un detector RALS/LALS. En este caso, el detector RALS sería el detector principal utilizado para cálculos, con el detector LALS registrando agregados o componentes más grandes en la muestra. Dado que las proteínas son generalmente dispersores isotrópicos, no hay un beneficio adicional de tener los numerosos detectores en diversos ángulos incluidos en un detector MALS.

Para ilustrar este punto, se midieron los pesos moleculares de varias proteínas utilizando tanto un detector RALS como MALS. Los datos resultantes se presentan en la figura a continuación, en la que está claro que se obtienen los mismos pesos moleculares de ambos detectores. Esto confirma que un detector RALS proporciona los mismos resultados que un detector MALS para muestras que muestran dispersión isotrópica.

Pesos moleculares de proteínas calculados utilizando detectores RALS y MALS; Pesos moleculares en kDa

Si no solo estás interesado en el peso molecular, sino también en el tamaño molecular, entonces un detector MALS ofrece la capacidad de calcular el radio de giro (Rg) de una muestra. Sin embargo, hay una salvedad: esto solo es posible para muestras con un radio mayor a 10-15 nm, ya que el Rg se calcula a partir de la pendiente generada por la dependencia angular en la parcela Zimm parcial. Si la muestra es un dispersor isotrópico, entonces no hay pendiente y Rg no se puede determinar. Como comentario adicional, el radio hidrodinámico (Rh) de muestras hasta unos pocos nm puede determinarse combinando los datos de viscosidad intrínseca (IV) de un detector de viscosímetro con los datos de peso molecular obtenidos de un detector de dispersión de luz.

Además, puede haber algunos ítems prácticos a considerar específicos de tu aplicación. Si estás integrando múltiples detectores, particularmente para aplicaciones UPLC, por ejemplo, la celda de flujo más pequeña presente en el detector RALS/LALS puede ser beneficiosa. Alternativamente, si anteriormente has sufrido de contaminación de una celda de dispersión de luz, puedes encontrar que una orientación particular de la celda (como la celda de flujo vertical en el SEC-MALS 20) ofrece resistencia y fiabilidad adicionales.

Por supuesto, la preferencia personal siempre es un factor al decidir sobre un detector de dispersión de luz. Tal vez siempre has usado un detector MALS y te sientes más cómodo calculando pesos moleculares usando un modelo de extrapolación específico. O tal vez prefieres la simplicidad y la precisión del enfoque RALS/LALS para calcular el peso molecular. O quizás estás trabajando dentro de un presupuesto y deseas maximizar el valor de tu instrumento.

Quiero comentar rápidamente sobre este último ítem, ya que es algo con lo que todos pueden identificar. El costo de estas unidades detectoras escala de acuerdo al número de detectores individuales de dispersión de luz presentes. En la configuración RALS/LALS hay dos detectores; en el SEC-MALS 20, hay veinte. Los precios varían en consecuencia. No hay una desventaja práctica al tener el rango de ángulos disponibles en un detector MALS, pero como se discutió anteriormente con respecto a los dispersores isotrópicos, los ángulos adicionales no siempre proporcionan información adicional.

Y aunque no es la ruta más rentable, incluso puedes tener ambos detectores MALS y RALS/LALS en el mismo sistema, recopilar los datos simultáneamente y luego decidir cuál utilizar para los cálculos durante el análisis de datos.

¡Con suerte, he proporcionado suficiente información en este post para ayudarte a determinar si un detector MALS o RALS/LALS (o ambos) es la mejor opción para ti y tu aplicación. ¡Cualquiera que elijas, te tenemos cubierto!

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