Réduisez le risque de stabilité avant qu’il ne devienne un problème
Un candidat qui passe le criblage de liaison n’est pas nécessairement un candidat qui survivra au développement.
L’agrégation, l’instabilité colloïdale et la sensibilité thermique comptent parmi les raisons les plus courantes de l’échec des biothérapeutiques en aval – et elles passent souvent inaperçues parce que les mesures capables de les détecter sont appliquées trop tard.
La fenêtre entre la confirmation du hit et la nomination du lead est le moment où le risque de stabilité est le plus maîtrisable. À ce stade, les volumes d’échantillon sont faibles, le pool de candidats est encore suffisamment large pour permettre des sélections pertinentes, et le coût d’éliminer une molécule problématique n’est qu’une fraction de ce qu’il sera plusieurs mois plus tard dans le programme. À mesure qu’un programme de biothérapeutiques passe de la découverte et du développement précoce à l’étape préclinique, la validation des hits laisse place à l’optimisation des leads et des candidats, avec un besoin croissant de caractérisations biophysiques plus approfondies et plus étendues. C’est à ce moment que le criblage de stabilité passe d’un rôle de soutien à un rôle central.
Dans cet article, nous nous concentrons sur la puissance de la diffusion dynamique de la lumière (DLS) et de la diffusion statique de la lumière (SLS) comme fondement du criblage précoce de stabilité, ainsi que sur la manière dont elles fonctionnent aux côtés de l’analyse du suivi de nanoparticules (NTA) et de la calorimétrie différentielle à balayage (DSC) pour établir une vision complète de la développabilité d’un candidat.
Pourquoi le risque de stabilité est un problème caché
Une molécule qui se lie à sa cible avec une forte affinité peut néanmoins s’agréger dans des conditions de formulation, se dénaturer pendant le stockage ou présenter un comportement imprévisible aux concentrations requises pour une administration sous-cutanée.
Pourtant, la survenue potentielle de ces problèmes reste largement invisible pour les tests de liaison et d’activité qui dominent le criblage précoce. Un criblage de liaison à haut débit peut vous indiquer qu’une molécule interagit avec sa cible, mais ne vous dit rien sur sa capacité à rester monodisperse à fortes concentrations, à supporter trois cycles de congélation/décongélation ou à conserver sa structure d’ordre supérieur sur toute la plage de pH d’un tampon de formulation typique.
Le criblage précoce de stabilité biophysique est conçu pour combler cette lacune en ajoutant les lectures orthogonales que les données de liaison ne peuvent pas fournir.
Ce que révèlent la DLS et la SLS — et pourquoi c’est important tôt
La diffusion dynamique de la lumière sur la gamme Zetasizer Advance mesure le rayon hydrodynamique des protéines en solution en exploitant la relation entre la taille des particules et leur vitesse de diffusion. Pour les candidats biothérapeutiques, c’est l’une des mesures précoces les plus riches en informations disponibles. Elle est aussi rapide à réaliser, nécessite peu d’échantillon et est sensible à des changements diagnostiques significatifs bien avant qu’ils ne deviennent visibles par d’autres moyens.
Le signal le plus précoce de formation d’agrégats
La dépendance à la sixième puissance de l’intensité de diffusion de la lumière vis-à-vis de la taille des particules rend la DLS disproportionnellement sensible aux espèces de grande taille. Un seul agrégat dans une population principalement monomérique génère un signal de diffusion largement disproportionné par rapport à sa contribution volumique. Cela signifie que la DLS peut détecter les tout premiers signes de formation d’agrégats à un stade où ils seraient totalement invisibles dans une distribution pondérée en volume ou en nombre. Le suivi de la taille et de la polydispersité au cours d’une rampe de température vous donne la température d’agrégation (Tagg), qui constitue un premier point mesurable où une formulation commence à échouer sous stress thermique.
Prédire le comportement aux concentrations de formulation
Tagg vous indique quand une protéine agrège sous stress thermique, mais pas pourquoi, ni comment le candidat se comportera aux concentrations élevées requises pour la formulation. Pour cela, deux paramètres d’interaction dérivés du même flux de travail de mesure DLS et SLS fournissent une réponse prédictive.
Le paramètre d’interaction de diffusion kD, dérivé de mesures DLS sur une série de concentrations, quantifie l’effet net des interactions protéine-protéine en solution. Un kD positif élevé indique des interactions répulsives : un candidat qui résiste à l’auto-association et qui a de fortes chances de rester stable aux concentrations de formulation. Un kD négatif signale des interactions attractives, prédisant une plus forte propension à l’agrégation et une viscosité plus élevée dans les conditions de formulation.
Le second coefficient du viriel B22, dérivé des mesures SLS, fournit la composante thermodynamique du même tableau. Des valeurs positives de B22 indiquent que la protéine préfère s’associer au solvant plutôt qu’à elle-même, ce qui en fait un indicateur favorable de solubilité et de stabilité colloïdale. Des valeurs négatives de B22 signalent des candidats à risque d’agrégation ou de précipitation.
Point crucial, ces deux paramètres sont dérivés des mêmes expériences en série de concentrations, tout comme kD est lié à B22. Il est préférable de mesurer directement B22, car il s’agit de la mesure thermodynamique, dépendante de la concentration, de l’attraction/répulsion nette entre protéines et donc d’un indicateur plus directement interprétable du risque d’agrégation, alors que kD est un proxy indirect basé sur la diffusion qui peut être faussé par de nombreux facteurs tels que la taille moléculaire, le frottement et la viscosité.
Cela signifie que kD, B22, Tagg, PDI et la distribution de taille des particules peuvent tous être obtenus à partir d’un seul instrument Zetasizer Advance dans le cadre d’un flux de mesure coordonné. C’est la valeur pratique du criblage précoce par DLS et SLS : identifier les conditions dans lesquelles l’agrégation est la plus susceptible de se produire, avant que des ressources importantes n’aient été engagées dans une formulation.
Résolution des populations complexes avec la NTA
La DLS mesure une moyenne d’ensemble de la population globale. Dans les échantillons hétérogènes où les espèces agrégées couvrent une large gamme de tailles, l’analyse du suivi de nanoparticules (NTA) sur le NanoSight Pro fournit des données de taille et de concentration particule par particule que la DLS d’ensemble ne peut pas résoudre.
Les deux techniques sont complémentaires : la DLS pour la rapidité, la sensibilité et l’extraction de paramètres colloïdaux ; la NTA pour résoudre et quantifier les populations agrégées plus importantes qui nécessitent une vue à plus haute résolution.
Ce que la DSC apporte au tableau
La DSC soutient la DLS et la SLS en caractérisant la stabilité structurale, en déterminant comment l’architecture repliée de la protéine réagit au stress thermique.
Le MicroCal PEAQ-DSC mesure la chaleur absorbée par une protéine lorsqu’elle se déplie à mesure que la température augmente. La température de fusion (Tm) est la température à laquelle 50 % de la population protéique s’est dépliée. Une Tm plus élevée est généralement corrélée à une meilleure stabilité réelle dans des conditions de stockage, et une Tm plus basse constitue un indicateur précoce bien établi d’un risque de formulation.
Les données combinées de DSC et de DLS fournissent la capacité de distinguer deux modes d’échec mécaniquement distincts : l’agrégation couplée au dépliement, et l’agrégation qui se produit à des températures inférieures à celles de dénaturation, en tant qu’événement purement colloïdal.
Ces deux scénarios ont des implications différentes pour la stratégie de formulation et des impacts très différents sur le développement en aval. Identifier tôt le mode applicable à un candidat donné peut empêcher une équipe de formulation de passer des mois à optimiser des conditions pour une molécule présentant une vulnérabilité intrinsèque qui ne peut pas être entièrement résolue.
Du criblage à la développabilité
Utilisées ensemble et appliquées tôt, la combinaison DLS, SLS, NTA et DSC donne aux équipes de développement les données nécessaires pour prendre de meilleures décisions sur les candidats au moment où l’échec est encore évitable.
Un candidat qui présente une excellente affinité mais un PDI élevé, un kD négatif et une Tm nettement inférieure à la norme du secteur a révélé quelque chose d’important : il s’agit d’un handicap en matière de développabilité. Le détecter lors de l’évaluation du lead candidate est fondamentalement différent de le détecter pendant le développement de la formulation, lorsque le candidat préféré a déjà été retenu.
À l’avenir, l’émergence de plateformes à haut débit capables d’effectuer des mesures DLS, SLS et de stabilité structurale basées sur la fluorescence intrinsèque pourrait étendre cette capacité de criblage précoce à une échelle auparavant impraticable avec des instruments individuels. Cela apporterait la profondeur de caractérisation décrite ici aux toutes premières étapes de l’entonnoir des candidats.
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