Repousser les limites de la recherche de hits pharmaceutiques avec le nouveau dosage cinétique waveRAPID

Résumé

Les campagnes de criblage à haut débit de milliers de composés pour la recherche de médicaments peuvent produire un grand nombre de hits montrant une interaction potentielle avec la cible médicamenteuse. Les affinités de liaison peuvent provenir d'une analyse à l'état d'équilibre à partir de nombreux dosages à haut débit. Une caractérisation complète de la cinétique de liaison est nécessaire pour sélectionner les hits susceptibles de faire l'objet d'un développement ultérieur. Cela permet d'identifier les composés qui amènent spécifiquement à la cible souhaitée avec des taux de liaison cinétique favorables. Dans la pratique, cela signifie que des études cinétiques approfondies doivent être effectuées sur un grand nombre de hits de criblage. À ce jour, cette opération demande énormément de temps et de matériel. Des séries de dilution adaptées à partir de centaines de hits doivent être préparées et chaque concentration doit être injectée en réplicats. Creoptix a mis au point une nouvelle technologie qui peut rendre ces projets beaucoup plus efficaces, en permettant une caractérisation cinétique fiable à partir d'un échantillon à une seule concentration. Le Creoptix waveRAPID sur le Creoptix WAVE représente un changement de paradigme pour les mesures cinétiques dans un contexte de criblage.

Dans la présente étude, réalisée par un groupe de recherche de médicaments par HTS (criblage à haut débit) de notre client Idorsia Pharmaceuticals Ltd, nous démontrons la puissance du waveRAPID dans la rationalisation de la caractérisation cinétique d'un grand nombre de hits médicamenteux. Dans plusieurs expériences, les cinétiques de liaison de 146 hits maximum ont été déterminées par le waveRAPID, en utilisant des injections pulsées d'échantillons à une seule concentration sur la cible médicamenteuse préalablement immobilisée sur la matrice du capteur. Tous les composés analysés avaient déjà été étudiés sur des instruments de SPR de pointe, à l'aide de mesures cinétiques multicycles traditionnelles. 

La comparaison des données obtenues à partir des deux technologies a révélé une excellente corrélation pour les constantes de dissociation calculées (K_D) avec seulement quelques valeurs aberrantes. Ce résultat valide la technologie waveRAPID sur le Creoptix WAVE pour l'application dans la recherche précoce de médicaments, ce qui permet de générer des données cinétiques approfondies dans une configuration de criblage à haut débit. Le temps de caractérisation de chaque composé étant réduit à seulement quelques minutes, il est possible d'économiser beaucoup de temps et de matériel. De grandes campagnes visant à déterminer la cinétique de liaison de centaines de composés peuvent être menées en plusieurs jours plutôt qu'en plusieurs semaines par rapport aux instruments de SPR de pointe actuels. 

Par ailleurs, la technologie waveRAPID a généré des données fiables, même pour les composés difficiles (comme ceux présentant une contribution importante de l'indice global de réfraction ou une dissociation lente) tout au long de la série de dosages. De tels composés nécessitent souvent une régénération de surface et une réimmobilisation de la protéine de ligand. Cela interrompt le flux de travail lors de campagnes de mesure plus importantes utilisant des dosages multicycles traditionnels. Enfin, le Creoptix WAVE, ainsi que la nouvelle méthode waveRAPID, permettent une configuration de dosage extrêmement simple, offrant une analyse de la cinétique de liaison complète à partir d'une seule concentration par échantillon. En outre, le moteur d'évaluation unique et novateur de cinétique directe de Creoptix, basé sur l'estimation des paramètres statistiques, fournit un flux de travail d'analyse automatisé et fiable incluant un calcul réel des erreurs statistiques. La technologie waveRAPID et le moteur d'évaluation automatisé de cinétique directe représentent un ensemble puissant qui a le potentiel de transformer la façon dont les dosages de liaison cinétique sont effectués dans la recherche précoce de médicaments aujourd'hui.

Matériels et méthodes

Protocole Creoptix

La protéine cible 1 marquée à l'histidine et la protéine cible 2 marquée à l'histidine ont été capturées à une densité de 4 000 à 5 000 pg/mm² sur une puce WAVEchip 4PCP-NTA précédemment chargée avec des ions Ni²⁺. Des injections pulsées waveRAPID de composés ont été effectuées à partir d'une solution d'échantillon de 10 μM pendant 25 s et suivies d'une injection de tampon pendant 250 s avec un débit de 32,5 μl/min par cellule à circulation. Toutes les mesures ont été effectuées dans un tampon de phosphate de 50 mM avec du Tween-20 à 0,05 % et du DMSO à 5 %. Les données ont été doublement référencées en soustrayant le signal du canal de référence et des injections à blanc. La concentration apparente des composés dans la zone de détection au cours des 6 impulsions d'injection a été étalonnée avec une injection pulsée de tampon de migration complété de DMSO à 0,5 % supplémentaire, en utilisant les mêmes paramètres d'injection que pour les échantillons de composés. L'analyse cinétique a été réalisée par le moteur d'estimation Direct Kinetics en utilisant un modèle de liaison 1:1.

Protocole Biacore

La protéine cible 1 marquée à l'histidine et la protéine cible 2 marquée à l'histidine ont été capturées à une densité de 4 000 à 5 000 pg/mm² sur une puce Ni-NTA précédemment activée avec des ions Ni²⁺. Les analytes ont été ajustés à la concentration souhaitée par une dilution en série dans un tampon de migration (tampon de phosphate de 50 mM avec du Tween-20 à 0,05 % et du DMSO à 5 %). Les sensorgrammes ont été obtenus avec un temps d'association de 100 s, un temps de dissociation de 250 s et un débit de 40 μl/min. Pour déterminer la cinétique de liaison (k_on, k_off et K_d), les sensorgrammes obtenus après double référencement ont été analysés par le logiciel Biacore T200 Evaluation en utilisant un modèle de liaison 1:1.

Résultats

La nouvelle technologie waveRAPID d'acquisition rapide de données de liaison cinétique dans un contexte de criblage a été validée par rapport aux instruments et à la méthodologie de pointe dans cette étude. Comme le montre la figure 1, les données de liaison cinétique peuvent être générées rapidement pour un grand nombre de hits de criblage, par injection pulsée de chaque échantillon à une seule concentration. En incluant la dissociation de l'analyte, chaque mesure a pris environ 5 minutes. Les profils de réponse couramment générés par le waveRAPID sont présentés à la figure 1, dans les panneaux A et B (données en rouge et modèle cinétique 1:1 en noir). Les paramètres évalués sont indiqués dans une carte de taux dans le panneau C (composé témoin injecté pendant l'ensemble du dosage dans le cercle noir), démontrant une excellente reproductibilité. Les temps de dosage et le débit d'échantillons courants en comparant un dosage représentatif avec 384 échantillons sur deux cibles sont répertoriés dans le tableau 1. 

Figure 1 : application de la GCI sur le Creoptix WAVEdelta pour la recherche et la caractérisation précoces de hits médicamenteux à l'aide de la nouvelle technologie waveRAPID. Une caractérisation cinétique complète peut être obtenue à partir de composés injectés à une seule concentration dans un contexte de criblage avec waveRAPID, ce qui permet de réaliser d'importantes économies de temps et d'argent lors de la recherche précoce de hits médicamenteux.
(a) Une sélection représentative des profils de réponse waveRAPID à partir d'un criblage de 80 composés est présentée.
(b) En utilisant des réglages d'injection personnalisés à partir de réglages prédéfinis pouvant être sélectionnés dans WAVEcontrol, toute la gamme d'affinités peut être couverte. Dans ce cas, des réglages pour les liants intermédiaires ont été utilisés (injection pulsée de 20 secondes, dissociation de 250 secondes), permettant ainsi la résolution des affinités de faible nanomolaire à faible micromolaire.
(c) Les taux cinétiques sont indiqués dans une carte de taux avec des affinités identiques sur les lignes diagonales. Les points de données du cercle montrent l'excellente reproductibilité du composé témoin pendant l'ensemble du dosage.

Tableau 1 : temps d'exécution de dosage et débit d'échantillons représentatifs en comparant le waveRAPID sur le WAVEdelta aux technologies de pointe (Biacore T200, 8k) pour une caractérisation cinétique complète de 384 échantillons sur 2 cibles.

Les données cinétiques obtenues ont été filtrées pour détecter des erreurs sur les taux de liaison (inférieurs à 100 % de la valeur k_a absolue et inférieurs à 50 % de la valeur k_d absolue) et comparées aux données des mesures multicycles de SPR standard. Comme le montre la figure 2, la comparaison avec les mesures multicycles traditionnelles de SPR révèle une très bonne corrélation entre les deux ensembles de données. 

Figure 2 : les cinétiques de liaison des hits de criblage médicamenteux mesurées avec le waveRAPID sur le Creoptix WAVEdelta sont tracées par rapport aux valeurs obtenues par des mesures cinétiques multicycles traditionnelles réalisées sur un instrument Biacore T200. Les données waveRAPID ont été filtrées pour détecter les erreurs statistiques sur le taux d'association (k_a) inférieur à 100 % et le taux de dissociation (k_d) inférieur à 50 % du paramètre de taux calculé. La corrélation valide la méthode cinétique waveRAPID dix fois plus rapide que la méthode traditionnelle.

Pour mettre davantage le système à l'épreuve, une autre série de mesures a été réalisée, dans laquelle des composés plus difficiles causant des interruptions du flux de travail et une régénération de surface dans les mesures multicycles traditionnelles ont été testés tout au long du dosage. Ces molécules difficiles (présentant une réponse brute élevée ou une dissociation lente) ne perturbent pas l'ensemble du flux de travail sur le WAVE et rendent inutile toute régénération intermittente de surface, vraisemblablement en raison du temps de contact considérablement plus court de l'analyte avec la protéine cible. Comme le montre la figure 3, les paramètres de liaison cinétique de presque tous les composés d'intérêt ont quand même pu être évalués de manière fiable avec de faibles erreurs et le témoin positif a tout de même présenté une reproductibilité élevée.

Figure 3 : trente composés précédemment caractérisés ont été à nouveau mesurés dans un dosage contenant également 30 composés plus difficiles présentant une contribution élevée de l'indice de réfraction (IR) brut ou une dissociation lente, ainsi que le composé difficile injecté tout au long du dosage. Alors que les composés difficiles entraînaient des limitations majeures du flux de travail dans la cinétique multicycle traditionnelle, rendant nécessaire une régénération régulière de surface, le waveRAPID a permis un flux de travail fluide avec un temps de mesure continu sans surveillance. Les erreurs statistiques en pourcentage des constantes absolues calculées de taux d'association et de dissociation, telles que déterminées par le moteur d'estimation Creoptix Direct Kinetics, sont tracées respectivement sur l'axe horizontal et vertical. Les composés qui n'ont pas montré de comportement difficile dans les dosages précédents (marques vertes), ainsi que les réplicats du composé témoin (marques violettes), sont clairement identifiés par de faibles erreurs. De plus, les composés présentant des difficultés dans les dosages précédents en raison d'une contribution importante de l'indice de réfraction brut peuvent être analysés de manière fiable sur le WAVE avec de faibles erreurs (marques bleues). Les autres composés difficiles à analyser sont clairement caractérisés par des erreurs plus importantes (marques rouges).

Conclusions

Grâce à sa sensibilité élevée, à sa capacité de résoudre des interactions extrêmement rapides et à sa technologie de dosage waveRAPID, le WAVEsystem permet de caractériser la cinétique d'un grand nombre de hits médicamenteux dans un temps considérablement plus court que les dosages cinétiques multicycles traditionnels. En obtenant la cinétique d'un seul puits en une seule injection, la consommation de réactifs et d'échantillons est réduite, ce qui profite considérablement à la recherche précoce de médicaments. En outre, le waveRAPID offre :

• des résultats comparables à ceux de la SPR traditionnelle en un temps beaucoup plus court ;
• un temps de contact réduit, ce qui préserve la protéine cible et permet des dosages plus longs et sans interruption ;
• une reproductibilité élevée et des résultats fiables ;
• une cinétique de liaison à partir d'une seule injection pour sélectionner les hits en fonction de paramètres pertinents ;
• plus d'interactions caractérisées en plusieurs jours plutôt qu'en plusieurs semaines ;
• un calcul approfondi des erreurs statistiques pour rechercher les hits pertinents et filtrer les composés problématiques.

Principaux points à retenir

• La réduction du temps de contact avec l'échantillon préserve l'intégrité de la cible pour des cycles plus longs
• Cinétique de liaison à partir d'une seule injection
• Reproductible et comparable aux technologies SP traditionnelles

Idéal pour :

• le criblage de mélanges bruts : petites molécules, fragments et peptides ;
• la progression rapide du processus de validation des hits en leads ;
• l'optimisation des leads ;
• les cibles instables ;
• les composés difficiles.
  

Remerciements

Nous remercions Geoffroy BOURQUIN, Laksmei GOGLIA, Solange MEYER et Oliver PETER pour avoir effectué toutes les expériences et contribué à ce document.