Sars-CoV-2 스파이크 RBD에 결합하는 Sybody® 후보물질을 비추는 조명

서론

일반적으로 단일 화학적 실체로 존재하는 기존의 소분자 약품과 달리 항체, 나노바디, 기타 생체계에서 제조된 대형 분자 등 생물제제는 매우 복잡합니다. 특히 많은 생물학적 약물은 여러 변형으로 존재하기 때문에 이러한 특성을 분석하는 데 어려움이 있으며 그 특성 및 풍부도는 제조 공정에 의해 크게 영향을 받습니다. 현재 코로나 바이러스가 대유행 중이므로 흡입형 나노바디 제형의 형태로 폐 전달에 적합함을 감안할 때 COVID-19 예방 치료법의 개발에 합성 단일 도메인 항체(나노바디 또는 Sybody라고도 함)가 핵심적인 역할을 할 수 있습니다.¹

결합 친화도 는 아마도 Sybody 분자와 같은 생물제제에서 가장 광범위하게 연구된 속성 중 하나일 것입니다. 그러나 약물의 다른 성질과 함께 평가되지 않는 한 결합 친화성은 임상 효능을 예측하는 데 충분한 정보를 제공할 수 없습니다. 생물학적 약물의 종합적인 특성 분석에는 항체-표적 상호 작용에 대한 정확한 결합 및 해리 속도 측정을 통한 결합 동역학의 실시간 분석도 포함됩니다.

여기서는 기존의 표면 플라즈마 공명(SPR) 기술에 비해 우수한 감도와 막힘 없는 미세유체를 사용하여 결합 친화도 및 결합 동역학을 보다 정확하게 측정하는 Creoptix WAVE가 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 영역에 대한 Sybody 후보물질의 결합 친화도 및 선택성에 대한 통찰력을 제공하여 생물제제 개발을 어떻게 주도하고 있는지 보여줍니다.

실험방법

ACE2 결합 동역학

비오티닐화 RBD-vYFP를 1000pg/mm²의 밀도로 스트렙타비딘 PCP-STA WAVEchip(폴리카복실레이트 준평면 표면, Creoptix AG)에 포획했습니다. 그런 다음 ACE2를 0.05% Tween-20(TBST)으로 보충된 TBS 완충액에서 6.25nM~400nM 범위(2배 연속 희석, 7가지 농도)의 증가하는 농도로 주입했습니다. ACE2는 채널당 15μl/min 유량으로 360초 동안 주입했고, 기준선으로 돌아갈 수 있도록 해리를 1200초로 설정했습니다. 센서그램을 25°C에서 기록하고 WAVEcontrol을 통해 데이터를 분석하였습니다. 빈 주입 및 참조 채널에서 신호를 차감하여 데이터를 이중 참조했습니다. 데이터 피팅에 Langmuir 1:1 모델을 사용했습니다(그림 1 참조). 

ACE2 경쟁

선택된 Sybody(TBST에서 500Nm) 단독, ACE2(TBST에서 250Nm) 단독 또는 Sybody(500Nm) 및 ACE2(250Nm)의 혼합물을 300초 동안 주입했으며, 매번 기준선으로 돌아갈 수 있도록 해리를 1200초로 설정했습니다. 센서그램을 25°C에서 기록했으며, 빈 주입 및 참조 채널에서 신호를 차감하여 이중 참조한 후 WAVEcontrol을 사용하여 데이터를 중첩했습니다. 

그림 1: 비오티닐화 스파이크 RBD에 대한 정제 ACE2의 결합 동역학

결과

연구 이력

이 협력은 링크스터 테라퓨틱스(Linkster Therapeutics AG)와 Markus Seeger 교수(취리히 대학교 병원미생물학연구소)가 Sybody 플랫폼을 사용하여 만든 57개의 우수한 거동의 독특한 Sybody 후보물질을 제공받은 것으로 시작되었습니다.² 따라서 모든 Sybody 후보물질이 Creoptix WAVE에서 해리 속도 선별을 거침으로써 스파이크 RBD에 대한 6가지 강력한 결합체를 식별했습니다. 그런 다음 ELISA 데이터와 일치하면서도 더 많은 동역학 세부 정보를 위한 결합/해리 속도를 제공하는 결합 상수를 측정하여 20~180nM 범위의 친화도를 밝혔습니다.³ ACE2/스파이크 상호작용과 동일한 범위의 친화도를 가진 엄격한 결합 특성을 고려하여 6개의 Sybody 후보물질을 추가로 특성 분석하고 스파이크 RBD에 결합하는 ACE2와 경쟁하는 능력을 조사하기로 결정했습니다.

Sybody 후보물질이 스파이크 RBD에 결합하는 ACE2와 경쟁합니다. SARS-CoV-2의 바이러스성 때문에 바이러스 스파이크 RBD가 인간 ACE2에 결합되어야 하므로, 공동 주입 시 선택된 Sybody 후보물질이 스파이크 RBD에 결합하는 ACE2를 억제하는 능력을 평가하였습니다. 

스트렙타비딘 PCP-STA WAVEchip가 비오티닐화 스파이크 RBD를 포획하는 데 사용되었고 Sybody 후보물질 및 정제 ACE2가 표시된 농도로 단독 또는 조합으로 주입되었습니다. 그림 2E에서 볼 수 있듯이, Sybody 16이 존재하면 스파이크 RBD에 대한 ACE2 결합이 거의 완전히 사라져 예외적으로 높은 수준의 ACE2-스파이크 상호작용 억제를 보여주었습니다. 이러한 억제는 Sybody 3 또는 Sybody 42(각각 그림 2C 및 2D)가 존재하는 경우에 부분적으로 발생했고 Sybody 67(그림 2B)에서는 전혀 비효율적입니다. 이 GCI 데이터는 이전에 보고된 ELISA 결과(그림 2E)와 일치하며, 이 억제 분석의 특성 분석을 가속화할 수 있다는 장점이 있습니다. 이러한 유형의 분석을 통해 수집된 증거는 Sybody 후보물질 3, 16 및 42가 스파이크 RBD에서 ACE2 결합 부위와 겹치는 표면 영역을 인식한다는 관찰 결과를 뒷받침합니다. 

그림 2: Sybody 후보물질이 스파이크 RBD에 결합하는 ACE2와 경쟁

결론

요약하면, 이 기술노트에서는 어떻게 Creoptix WAVE를 사용하여 이전에 게시된 Sybody 라이브러리에서 생성된 후보물질을 신속하게 특성 분석하고 이러한 Sybody 후보물질이 ACE2-스파이크 상호 작용을 어떻게 억제하는지에 대한 통찰력을 확인할 수 있는지 보여줍니다³. ELISA 데이터에 대한 신속한 직교 검증을 제공하는 Creoptix WAVE는 SARS-CoV-2에 대한 치료제 개발을 가속화함으로써 COVID-19 대유행병을 이해하기 위한 경쟁에서 앞서 나가는 데 이상적입니다.

핵심 내용

Creoptix WAVE 로 치료제 개발을 위해 결합 동역학을 이해하고 새로운 데이터를 생성하여 결과 및 간행물을 보강합니다. 

• 빠르고 통찰력 있는 억제 분석 : 더 신속하게 결합 특성을 분석하고 경쟁 동역학을 파악합니다. 
• ELISA 결과 검증 : 경쟁 분석 데이터의 상관 관계를 높은 신뢰도로 분석할 수 있습니다.

적합한 용도:

• 흡입 제형의 개발
• 항원형 매핑
• ELISA 데이터의 직교 검증

공지 사항

Venus YFP(RBD-vYFP)로 융합된 SARS-CoV-2 비오티닐화 스파이크 RBD 단백질과 Sybody 후보물질은 Markus Seeger 교수(IMM, 취리히)와 링크스터 테라퓨틱스(링크스터 테라퓨틱스)가 제공하셨습니다. 인간 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)의 정제된 히스타딘 표지 엑토도메인은 Matthieu Botte 박사(리드엑스프로)가 제공하셨습니다.

참고 문헌

1. van Heeke, G. et. al. 2017. Nanobodies as inhaled biotherapeutics for lung diseases. Pharmacol Ther. 169, 47-56. doi: 10.1016/j.pharmthera.2016.06.012 
2. Zimmermann, I. et al. 2018. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife 7:e34317. doi: 10.7554/eLife.34317
3. Walter, J.D. et al. 2020. Sybodies targeting the SARS-CoV-2 receptor-binding domain. bioRxiv doi: 10.1101/2020.04.16.045419