最佳實踐：利用等溫滴定量熱法研究結合相互作用 – 第1部分

經過 Verna Frasca, Thursday, 10th January 2019

以下是使用 MicroCal PEAQ-ITC、VP-ITC 和 ITC200 系統進行傳統結合實驗的幾個最佳實踐。

樣品要求：

    • 按照慣例，在等溫滴定量熱儀（ITC）細胞中的“高分子”是生物分子，而“配體”是ITC注射器中的生物分子。這些可以是任何互相作用的分子（蛋白質、核酸、小分子抑制劑、金屬等）。也可以進行“反向滴定”，使“配體”在注射器中。
    • 為了數據分析到一組位點結合模型，“配體”有一個結合位點以及其他常用的ITC數據分析模型。“高分子”可以有任意數量的結合位點。
    • 所有樣品應儘可能純淨，以便用於ITC。避免或消除化學和構象上的雜質，因為這些可能影響準確的濃度測定，並可能參與或干擾結合相互作用。
    • 為了獲得高質量的ITC數據，必須將兩個生物分子匹配在所需的緩衝液中，以避免因緩衝液不匹配導致的熱量變化。

Malvern MicroCal ITC range 

  • ITC的緩衝液：
    • 使用能夠保持生物分子溶解度和穩定性的緩衝液，包含任何結合所需的鹽、輔助因子和添加劑。
    • 作為初始點，可以使用其他結合研究中使用的相同緩衝液。
    • ITC與pH2-pH12之間的水性緩衝液兼容。確保緩衝液濃度足夠在存在生物分子的情況下保持pH值。
    • 如果緩衝液中含有甘油（或其他黏性成分），保持甘油濃度低於20%（v/v），以避免在ITC池和注射器中產生氣泡。
    • 如果緩衝液中含有表面活性劑或洗滌劑，保持表面活性劑濃度低於其臨界膠束濃度（CMC），除非您正在研究ITC中的膠束。
    • 如果需要還原劑，我們推薦使用TCEP或2-巰基乙醇。不建議使用二硫蘇糖醇。
    • 如果配體需要DMSO以溶解，確保在結合夥伴中具有相同的最終DMSO濃度。ITC結合研究建議的上限是10%DMSO。
    • 如果需要使用其他有機溶劑，檢查儀器的技術文獻或諮詢您所在地區的Malvern Panalytical支持團隊，獲取建議和ITC系統的化學兼容性。

樣品體積：

  • 請參閱表1。這些是按照推薦協議所需填充ITC池和注射器的建議體積，且無需加入氣泡。

表1：MicroCal ITC的ITC池和注射器樣品體積

樣品濃度：

  • ITC池中的起始高分子濃度通常由“C參數”或“sigmoidocity係數”確定，其計算公式為：
    C= N[M]T/KD       
  • [M]T是ITC細胞中的高分子濃度，而N是化學計量。為獲得合理的ITC結合等溫圖，最佳範圍為5 < C < 500。在很多情況下，當C介於1和1000之間時，您可以從ITC結合曲線中獲得一些有用的數據。
  • 對於1:1的結合，開始時使用ITC注射器中比ITC細胞中高分子濃度高10倍的配體濃度。
  • 如果估計的KD，並且是1:1的結合，請使用表2中的指南。假設存在合理的熱量變化和結合焓，這些濃度範圍應該可以提供結合曲線。
  • 如果KD未知，請嘗試ITC池中20 μM樣品和ITC注射器中200 μM樣品。
  • ITC池中的最低濃度：5-10 μM
  • ITC注射器中的最低濃度：50 μM

表2：如果您有估計的KD，並且是1:1結合，則ITC實驗的建議濃度

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