在穩定性成為問題之前先降低風險
能通過 binding screening 的候選物，不一定就能在開發過程中存活下來。
聚集、膠體不穩定性與熱敏感性，是生物製劑在後續開發中失敗的最常見原因之一；而且它們往往不會被察覺，因為能夠捕捉這些問題的測量通常做得太晚。
從 hit 確認到 lead 提名之間的窗口，是穩定性風險最容易管理的階段。在這個階段，樣品量很小，候選分子池仍然夠大，足以做出有意義的篩選，而淘汰問題分子的成本，只是再往後幾個月於專案中才發現問題時所需成本的一小部分。當生物製劑專案從發現與早期開發階段過渡到臨床前階段時，hit 驗證會讓位給 lead 與候選物優化，並伴隨著對更深入、更多面的生物物理表徵需求日益增加。這時，穩定性篩選就從輔助角色轉為核心角色。
在這篇部落格中，我們將聚焦於動態光散射（DLS）與靜態光散射（SLS）在早期穩定性篩選中的基礎作用，以及它們如何與奈米粒子追蹤分析（NTA）和差示掃描量熱法（DSC）協同工作，建立對候選物可開發性的完整圖像。
為什麼穩定性風險是一個隱藏問題
一個與其靶點具有高親和力結合的分子，仍可能在配方條件下聚集、在儲存過程中變性，或在皮下注射所需的濃度下表現出不可預測的行為。
然而，這些 問題 發生的可能性，對於主導早期篩選的結合與活性分析來說，幾乎是看不見的。高通量結合篩選 可以 告訴你某個分子是否與其 靶點 互動，但無法告訴你該分子在高濃度下是否仍能保持單分散、是否能承受三次凍融循環，或是否能在典型配方緩衝液的整個 pH 範圍內維持其高階結構。
早期生物物理穩定性篩選的目的，就是透過加入結合數據無法提供的正交讀值，來彌補這個差距。
DLS 與 SLS 能揭示什麼 — 以及為何這在早期很重要
在 Zetasizer Advance range 上進行的動態光散射，利用粒徑與擴散速率之間的關係，測量溶液中蛋白質的流體動力學半徑。對於生物治療候選物而言，這是最具資訊密度的早期測量之一。它也 運行快速、所需樣品極少，並且能在其他方法尚未看出變化之前，就對具有診斷意義的變化保持高度敏感。
聚集形成的最早信號
光散射強度對粒徑的六次方依賴，使 DLS 對較大物種格外敏感。在以單體為主的族群中，只要有一個聚集體，就會產生遠高於其 體積 貢獻的散射訊號。這 表示 DLS 能在聚集體形成的最早階段就發出警示；而在以體積加權或數量加權的分佈中，這些訊號本來會完全看不見。沿著溫度梯度監測粒徑與多分散性，可得到聚集溫度（Tagg），也就是配方開始在熱應力下失效時的一個可早期量測的指標。
預測在配方濃度下的行為
Tagg 可告訴你蛋白質在熱應力下何時開始聚集，但無法說明原因，也無法預測候選物在配方所需高濃度下會如何表現。為此，來自相同 DLS 與 SLS 測量流程的兩個交互作用參數，可提供前瞻性的答案。
擴散交互作用參數 kD 是由跨濃度系列的 DLS 測量推導而來，用於量化溶液中蛋白質-蛋白質交互作用的淨效應。較大的正 kD 表示排斥性交互作用：代表候選物較不易自我結合，且在配方濃度下更可能保持穩定。負的 kD 則表示吸引性交互作用，預示在配方條件下有更高的聚集傾向與更高的黏度。
第二維里係數 B22 是由 SLS 測量推導而來，提供同一圖像中的熱力學面向。正的 B22 值表示蛋白質較偏好與溶劑結合，而非彼此自我結合，因此是溶解度與膠體穩定性的有利指標。負的 B22 值則提示候選物有聚集或沉澱風險。
關鍵在於，這兩個參數都可由同一組濃度系列實驗取得，因為 kD 與 B22 彼此相關。直接測量 B22 較佳，因為它是熱力學、隨濃度變化的蛋白質-蛋白質總吸引/排斥測量，因此對聚集風險的解讀更直接；相較之下，kD 是一種間接的擴散基礎代理指標，可能受到分子大小、摩擦與黏度等多種因素影響而失真。
這 表示 kD、B22、Tagg、PDI 以及粒徑分佈，都能透過單一 Zetasizer Advance 儀器，在協調一致的量測流程中取得。這就是早期 DLS 與 SLS 篩選的實際價值：在投入大量資源進入配方開發之前，就先辨識出最可能發生聚集的條件。
使用 NTA 解析複雜族群
DLS 量測的是整體族群的集合平均值。對於聚集物種跨越廣泛粒徑範圍的異質樣品，安裝於 NanoSight Pro 上的奈米粒子追蹤分析（NTA）可提供逐粒子的粒徑與濃度資料，而這是集合式 DLS 無法解析的。
這兩種技術是互補的：DLS 著重速度、靈敏度與膠體參數萃取；NTA 則用來解析與定量需要更高解析度視角的較大型聚集族群。
DSC 對整體圖像的補充
DSC 透過 表徵 結構穩定性，來補強 DLS 與 SLS，判定蛋白質摺疊架構如何對熱應力作出反應。
MicroCal PEAQ-DSC 測量蛋白質在溫度升高並逐漸展開時所吸收的熱量。熔解溫度（Tm）是指 50 % 的蛋白質族群已展開時的溫度。較高的 Tm通常與儲存條件下更佳的真實穩定性相關，而較低的 Tm則是已被廣泛認可的配方風險早期指標。
將 DSC 與 DLS 數據結合，可區分兩種機制上截然不同的失效模式：與展開耦合的聚集，以及在低於變性溫度下、純粹作為膠體事件發生的聚集。
這兩種情境對配方策略有不同意涵，並對後續開發造成非常不同的影響。若能及早辨識某個候選物屬於哪一種模式，就能避免配方團隊花費數月時間去優化一個本質上就帶有、且無法完全解決的缺陷分子。
從篩選走向可開發性
若及早並且搭配使用，DLS、SLS、NTA 與 DSC 的組合可讓開發團隊在失敗仍可避免的階段，掌握做出更佳候選物決策所需的數據。
一個雖然親和力極佳，但 PDI 很高、kD 為負、且 Tm 明顯低於業界常態的候選物，已經揭示了一件重要的事：它在可開發性上是一項負擔。若能在 lead 候選物評估期間就發現這一點，與在配方開發期間、當首選候選物已被提名之後才發現，兩者是根本不同的。
展望未來，能夠執行 DLS、SLS 與基於內在螢光的結構穩定性量測之高通量平台的出現，可能會把這種早期篩選能力擴展到以往單一儀器難以實現的規模。這將把本文所描述的表徵深度，帶到候選分子流程的最早階段。
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