DSC與蛋白質穩定性：焓變化意味著什麼？

差示掃描量熱法（DSC）是唯一能夠直接測量熱轉變焓變化（∆H）的分析方法，例如蛋白質、核酸或其他生物聚合物的熱變性。

什麼是∆H？

∆H是在恒壓下將系統提高到溫度T所吸收的總能量。對於蛋白質來說，這意味著用於展開它的能量（熱量），並且∆H為正，代表吸熱過程。這種能量與所有原子和分子的運動以及保持蛋白質在折疊構象中的鍵的能量相關聯。

∆H是通過積分熱譜圖下的面積來計算的（見下圖），表示為每摩爾蛋白的卡路里（或焦耳）。當蛋白質在DSC實驗中暴露於不斷升高的溫度時，蛋白質開始熱變性，因為非共價鍵被打破。∆H與需要保持蛋白質在其天然（折疊）構象中的鍵數量有關。

∆H取決於我們測量總蛋白質濃度的準確性。如果蛋白質濃度未能精確確定，計算得到的∆H值將會受到影響。

在實踐中，∆H值告訴我們什麼？

當您比較不同蛋白質的DSC結果時，∆H值較大的蛋白質不一定比∆H值較小的蛋白質更穩定。由於∆H是按總摩爾蛋白濃度歸一化的，因此該值通常與蛋白質的大小成正比。大多數蛋白質具有相同的鍵密度（每體積鍵）。可以合理地預期，具有較大分子量的蛋白質也將具有更大的∆H。

∆H依賴於溶液中天然蛋白質的百分比

一個重要的考慮因素是，DSC僅測量最初處於折疊（天然）構象的蛋白質的∆H值。∆H的大小取決於折疊部分的濃度。如果初始折疊蛋白質部分佔總蛋白濃度的不到100％，則計算所得的∆H值將相應地減小。

下圖顯示了在不同貯藏期間測量的相同蛋白質的DSC熱譜圖。藍色熱譜圖對應於剛制備的100％天然（折疊）蛋白質。隨著蛋白質樣品在貯藏期間退化，溶液中的天然蛋白質部分開始減少，導致DSC熱譜圖中的焓減少。我們可以使用不同熱譜圖的相對∆H值來估計每個樣品的折疊蛋白分數，前提是我們擁有一個100％天然蛋白質的參考DSC熱譜圖。

在這個例子中，綠色熱譜圖的樣品的∆H為藍色樣品的50％，所以它是50％的折疊蛋白。橙色樣品具有25％的折疊蛋白，而紅色樣品具有10％的折疊蛋白，相對於藍色熱譜圖。

量熱焓與范特霍夫焓

到目前為止，我們在這篇博文中討論的是由DSC直接測量的“量熱”焓，通常表示為∆H_cal。我們還可以從DSC數據中計算出另一種類型的焓，范特霍夫焓 – ∆H_vH。該值可從DSC非雙態模型擬合中獲得。∆H_vH也是從任何非量熱（間接）熱熔技術（如圓二色性）中確定的焓。

在DSC中，∆H_cal僅由過渡峰下的面積決定，而∆H_vH僅由過渡峰的形狀決定。過渡越尖銳，∆H_vH越大，反之亦然。∆H_cal是濃度依賴的，但H_vH不是。

通常，∆H_cal/∆H_vH比值等於1被認為是所研究的過渡符合雙態展開機制的指示。∆H_cal/∆H_vH比值大於1則表明存在顯著聚集的中間體；而∆H_cal/∆H_vH比值小於1則指示分子間相互作用。

使用∆H_cal/∆H_vH我們可以估計大部分蛋白質為非活性。如果我們有一個簡單的單域蛋白，並假設沒有中間體，可以預期其展開將有一個不遠於1的∆H_cal/∆H_vH比值。因此，如果∆H_cal顯著低於∆H_vH，可能表明大部分蛋白質已經失活。

總而言之，DSC對∆H數據的分析可以提供對蛋白質展開機制的見解，以及多少蛋白質處於其天然構象中。

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