LALS 為什麼越近越好？- Viscotek GPC 系統

 

序論 


  目前 GPC/SEC(膠體滲透色譜/排除尺寸 色譜) 實驗中在測量分子量時 激光光散射檢測器被廣泛使用。  

  分子量可以直接從 LS(光散射) 檢測器信號中測量 的優點使得無須使用高分子 或標準蛋白來校正 洗脫體積，因此被許多 用戶所喜愛。此外，用 LS 檢測器測量的 分子量與聚合物類型和結構無關。  

 

  基於這些原因，GPC-LS 測得的分子量被稱為 絕對分子量。 實際上，所有 GPC-LS 檢測器都需要校正工作，目前使用中的大多數 LS 檢測器通過數據外推或數據校正來獲得分子量，因此稱為絕對值存在相當大的差距。 

 


  本應用筆記將解釋與此問題相關的 理論，並說明 LALS(低角光散射)是唯一能實際測量與分子量成正比的散射光角度的 LS 技術。 

光散射理論 


  首先，需要了解測量的容量(散射光強度)和 想要的結果(重量平均分子量)之間的 相關性。這兩個參數與著名的 Releigh 方程相關。  

  此時，R=o 代表 o 度時的散射強度，Mw 代表平均分子量，c 代表溶液的濃度，K 代表光學常數值，dn/dc 和 A2 代表第二維里爾係數。 

 


  在低濃度溶液的情況下(例如，一般的 GPC 條件)，由於濃度非常低，可以忽略這些影響。因此公式簡化如下。 

 


  使用簡化的公式，從散射光的值可以直接求得 Mw。  然而，必須理解這個方程是基於 0 度(例如 0°)的散射光。  

  當然，由於入射激光束，不可能在 0°測量散射光，因此需要在幾個其他角度測量散射光(圖 1)。然而，這使過程變得複雜，因為散射光的量隨著散射角和測量的分子大小而有很大不同。  

  當分子大小非常小時，可以忽略這種角度依賴效應。分子尺寸大於 12nm，溶液中會出現問題。(1) 

 


根據這一理論，基本上有三種解決方案。  

 


1. 多角度光
散射(MALS)。測量兩個或更多角度的散射光，並在 0 度外推數據。  

 


2. 90 度光散射/粘度(RALS/粘度)。
在 90°測量散射光，使用粘度數據校正 0°值。  

 


3. 低角度光
散射(LALS)。測量在靠近 0°的低角度，使角效應能夠忽略。這種情況下不需要校正。   

  使用 MALS 和 RALS/粘度的幾百種設備目前被廣泛使用於全世界，但是，這些產品中沒有一個能夠直接測量分子量。  

 


  Multi-angle 方法總是依賴於數據外推，而 RALS 方法需要使用粘度計對于大分子的數據校正。  

 


  從歷史上看，自第一次校正之後，分子量被直接測量，因此 LALS 方法被視為唯一的絕對方法，因為不像 Multianlge 方法，需要估算和數據處理。  

  商用 LALS 檢測器以 1970 年代後期到 1980 年代後期生產的 Chromatix KMX-6 為基準。然而，1990 年代完全沒有生產 LALS 檢測器。  

  到 2001 年，新的 Viscotek 的 LALS 檢測器才被推出，GPC-LS 使用者才重新獲得可以直接測量絕對分子量的機會。  

 

 

Multi-angle 方法有問題的原因 

 


  Multi-angle 設備適用於在兩個或以上的角度測量散射光，然後在測量值上進行外推到 0 度。然而，相當多的用戶認為測得的值是絕對分子量。  

  然而，所有的 MALS 設備都需要校正步驟，因此這不是真的。此外，分子量不是直接測量的，而是通過數據外推所得。  

 


  這就是 MALS 方法的最大缺點。不同類型的數據圖或外推擬合存在，對於每一個樣本，應該應用哪一種？Debye？Zimm？Berry？對於低分子量，高分子量的時候，線性數據擬合有更準確的結果，所需的數據擬合不同(2)。 

 

  對於大於 45nm 的分子，數據圖顯示曲線形狀，根據所選擇的數據擬合，外推的分子量會有所不同。也就是說，對於同時存在小分子和大分子的寬範圍樣品，選擇的擬合順序會始終產生影響。  

 


  與此相關的 Multi-angle 方法的另一個問題，是缺乏輕微角度區域的重要數據。Multiangle 檢測器設計為從多個角度收集數據，實際上無法從實際低角度收集合準的數據。  

 

  結果是很難獲得準確的分子量。外推的準確性(擬合的適合度)由低角度數據點距離 0 的遠近及信號品質決定。(3)  

 

 

低角度光散射(LALS) 




  先進的LALS 方法通過測量盡可能接近 0 度的散射光(此處為 7°)來避免所有外推和數據擬合問題。 

 

  圖 2 是檢測器光學路徑的內部模型。此高效設計能夠有效區分散射光和入射光束(4)。結果是在 7°獲得出色的噪聲對比信號。 

 


  圖 3 是對比低分子量聚合物和高分子量聚合物在 90°(RALS) 和 7°(LALS) 的信號對噪音比。 

 


  圖 3a 顯示了對於低分子量 PEO 樣本，兩個檢測器都能夠無關於散射角獲得相同的結果。該色譜圖比較了 90°信號(RALS)和 LALS 信號對噪音，顯示出 LALS 提供了優異的信號對噪音。 

 


  LALS 直接測量的重要性表現在分析如多糖這種大的分子時最為顯著。這些類型的分子角度依賴性非常高 (圖 3b)，對於 RALS 與多角度方法特別會發生嚴重問題。  

 

  7°的散射光直接測量能夠不再需要外推或數據擬合，並且能夠產生準確的分子量。圖 4 顯示了使用 LALS 方法測量透明質酸樣品的結果(5)。
 

 

 

結論 

 


  隨著尖端設備 LALS 檢測器的出現，GPC/SEC 實驗室能夠準確測量樣品的分子量。  

 

  使用 LALS 能夠避免數據外推或數據擬合的問題。此外，新的 LALS 產品尺寸小，易於操作，能方便結合到集成粘度計的多檢測器系統(6)中，其同時測定分子量及分子結構。(7, 8)  

 

  這顛覆了角度越多越好的傳統理念。實際上，在測量散射光時，靠近的角度越好。