通往量热计大师之路 Vol.3 等温滴定量热计 iTC测量和分析的要点！
此处出现的人物和故事皆为虚构。
技术内容方面特邀了大阪府立大学客员研究员 深田老师提供建议。
丸番制药的仲村先生接到了上司田中先生的指示，着手启动量热计，但困难重重。为了深入理解，他带着需要确认的内容前往深田老师的地方。
通过一个个解决问题，仲村先生逐渐加深了对ITC现象及其原因的理解。
深田老师，暂时想操作一遍，请指导一下！
好的，明白了。让我们试试看吧。
系统是开机状态对吧，从几小时前开始开机比较好？
是的，我一般保持开机，那样系统更稳定。但是各个实验室可能有不同的规定，比如提前一天调好温度等，至少要提前一小时开机。若想让基线稳定，最好提前开机。当然，别忘了设置测量的温度！
了解。接下来，更换参考的超纯水。这一操作每周进行一次就可以，对吗？如果计划一周以上不使用系统，应该如何处理？即使这样也需要更换吗？
如果不打算使用则无需特意更换。只是任何水放置久了都可能滋生物质，因此每个月应至少更换样品和参考两个池的超纯水。重要的是，测量结束时，确保每个池中都装有新鲜的超纯水。 如果池子干燥而残留污垢，可能会附着上去。
明白了！接着是系统清洗。根据手册，使用控制软件的指令进行，选择Cell and Syringe Wash，按照屏幕上的指导进行即可。
是的，按指示执行没问题。如果需要更仔细地清洗，也可以使用其他指令。各指令的意义记载在手册中，请确认。
手册的42页。
如希望获得手册，请联系。
我每次样品测量后，使用洗涤剂清洗池，例如14% Decon90或20% Contrad 70。样品去除后，用气密注射器用超纯水冲洗。然后再用注射器装入洗涤剂，注意泡沫。严重污物时可用洗涤剂浸泡几分钟。清洗剂去除后，重复Cell Water Rinse (Long)以彻底清除洗涤剂。池清洁是获取良好数据的关键。
那么，注射器清洗有注意事项吗？
通常清洗时，在干燥过程结束后，检查玻璃部分和清洁位置内是否留有水滴。如果有水滴，可能干燥不充分，导致注射器样品混入甲醇。例如进行水—水测量时，如果出现大量放热反应，可能是甲醇混入。主要原因是入孔适配器安装不充分。
不太习惯这个适配器。
确实，可能需要几次使用才能习惯！关于注射器清洗还有一点。即使甲醇没有残留，在水—水测量中出现热反应，可能是滴定注射器被污染。手册中也有记录，请按照其指导用洗涤剂清洗。
42页可用。注射器干燥完毕，现在填充样品。没有水滴，并确保样品在室温下防止气泡。如样品中有气泡，是否需要脱气？
对于iTC200，基本不要求脱气。不过如果有可见气泡，情况就不同了。稍微在室温下离心以去除气泡基本没有问题。
明白了，也需要一些技巧。那么，向样品池装入EDTA，滴定注射器装入CaCl2。没有气泡，参数设置OK，开始！DP稳定后开始滴定。
好的。观察一下。
这次，仲村事先设置好了之前忘记的夹克温度，所以注射器立即开始旋转。如果测量温度与实际温度差距大，注射器不会立即旋转，请注意。
老师，关于基线稳定化的判断系统自带，但据说可以自行判断……
软件判断基线稳定时，即使有些漂移也会开始测量。iTC200的信噪比良好，漂移对测量结果影响不大。要理解的是，为什么基线不稳定呢？
避免环境影响，如空调，这就是原因吧？
是的。还有其他原因，例如附近有强磁场的系统。空调或磁场影响下，可能会出现波浪式有规律的漂移。池内混入气泡也会导致漂移。气泡可预先存在，或由于池污染产生。样品池内有气泡，滴定注射会将气泡推出，基线随之上升或急剧升高。
开始测量时的DP需要在设定值的±1 µcal/sec内吗？
是的，但我觉得±1 µcal/sec有点宽松。尽量接近设定值，才是最重要的。基线应该大致稳定了吧？
是的，大概就在9.7 µcal/sec。哦，测量开始了。需要一小时左右，我们休息一下吧！
稍等，仲村。现在离开不是个好时机。
啊！？
至少在第二次滴定结束前等待。
直到第二次滴定？
核对基线的DP值算是通过。还有两个检查点。
两个！？
第一个是确认设置的参考功率是否适合所需的相互作用。一般生物大分子相互作用设为5 µcal/sec没有问题。这次目的为EDTA与CaCl2，设为10 µcal/sec。覆盖第一次滴定从少设定滴量，第二次滴定回到正常滴定量。
补充，设置滴定参数时，第一次滴为本定量的1/5。基线稳定前，滴定注射器与样品池溶液接触，致使界面的注射器内样品稀释。导致滴定时未按实际浓度进行。因此MicroCal ITC建议第一滴定不用于解析，使用少量样品滴下后进行本测。
关于参考功率，手册中的10 µcal/sec主要用于EDTA与CaCl2反应。生物大分子初滴热量高于-1 µcal/sec的情况应设为5 µcal/sec。这可以减少给池带来的额外热量，提高测量精度。
参考功率表明能测量多少放热量，这次设为10 µcal/sec，意即至少能测-10 µcal/sec。如出现放热信号超出Y轴零点，可能参考功率设置不够，难以测得准确放热量。
能在途中更改参考功率吗？
不，遗憾的是不能。测量过程中仅能更改Injection Parameter参数。
如果重设参考功率继续测量，浓度信息，特别是池的浓度会不准确，只能重新测量或仅用作参考值。
明白了。因第一次滴定样品量少，所以应确认到第二次滴定。那么另一个检查点是？
Spacing是否足够？ITC关键在于每次滴定的响应需恢复至基线。因为以峰面积为反应中的热量求值。如果Spacing不够，下一滴定将在基线恢复前开始，可能导致不准确的热量面积。
这次数据在参考功率范围内，响应也返回至基线。考虑到基线返回较晚，能更改Injection Parameters剧吗？
的确如此，仲村！需注意滴定末期出现基线回不去的现象，类似左图例子，Spacing设置需格外注意。那么，我们休息一下？
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