通往卡路里計量大師之路 Vol.4
讓我們來優化ITC實驗吧！
此處出現的人物與故事純屬虛構。
有關技術內容，我們得到大阪府立大學客座研究員深田博士的建議。
※本文結尾處提供資料下載。
【上次的故事】
丸番製藥的仲村先生承接了上司田中先生的指示，開始使用卡路里計量儀。在深田博士的指導下，他掌握了iTC200的測量和分析的基本知識。
【本次的故事】
已掌握基本技能的仲村決定先從手邊的抗體-抗原測量開始進行。抗原是購買的分子量大約50 kDa的蛋白質，而抗體則是自製的。從其他測量結果預測，親和力在數nM左右。
根據論文，大多數情況是將抗體放置於細胞中，抗原則放置於注射器中。根據C值(＊1)計算，當KD約為數nM時濃度太低，因此至少要確保10μM。1:1結合需要100μM的抗原，但抗體為二價，因此需要200μM的抗原。嗯？如果抗體設為5μM，抗原設為100μM可以嗎？想節約樣品，打算在低濃度下進行測量。首先進行控制實驗(＊2)。根據簡易日語手冊P.9.的條件，各滴2µl，滴定18次。但第一次滴定為0.4µl。
※1 有關C值的詳情，請參見通往卡路里計量大師之路Vol.2。
※2 有關控制實驗的詳情，請參見通往卡路里計量大師之路Vol.3。
稀釋熱似乎有點大？還是理所當然？那麼先來測量樣品吧。
控制實驗沒有太大變化吧？！測量後半的發熱量也未趨於零，緩衝液用的是相同成分的，緩衝液不匹配應該不太可能…是注射器髒了？不會吧，測量前系統已經檢查過了。深田博士～。
仲村先生，發生什麼事了？
其實，我的樣品是抗原和抗體。測量時兩項數據幾乎無差異。
哦，這樣啊。那到底測量的是什麼？有想出原因嗎？
DP值和設置的參考功率5μcal/sec對應，確定不是細胞的髒污問題。考慮到是滴定注射器的問題，我也有檢查滴定響應，但測量前檢查了系統沒問題。所以我認為是緩衝液不匹配的問題，但使用的緩衝液成分相同，不太可能。
您說「使用了相同的緩衝液成分」？未做樣品透析嗎？
是的。這次抗體是自製的，但抗原是購買的Carrier Free製品。使用了與用於抗體的凝膠過濾純化的相同緩衝液調製抗原濃度。
未透析過，抗原是使用凝膠過濾緩衝液調製的嗎？
嚴格說來，是為抗原溶液單獨調製的。但應該成分一致。
仲村先生，可能是緩衝液成分不同了。即便成分一致，試劑測量仍會造成輕微差異。即便同一天製成，過幾天關鍵成分可能改變。此外，Carrier Free凍乾後的條件可能尚未確認。如果使用過TFA或乙腈殘留成分，可能影響pH值等。
真是沒想到！
透析在確保樣品和滴定緩衝液成分盡可能一致時非常重要。特別對於購買的製品，為排除不確定因素，應與抗體一起進行透析。
明白。透析重測ITC好敏感…
補充說明。「精確匹配細胞和注射器的緩衝液成分」在ITC測量中極其重要。控制實驗中，如果觀察到顯著的熱反應以及進行滴定時的變化熱反應，這可能表示配體溶液與緩衝液之間存在不匹配。當然，檢測到注射器乾燥過程中引入的甲醇殘留不充分，也需要注意。
在實驗前檢查緩衝液的匹配。如果即使緩衝液匹配小心仔細但在控制實驗中仍無法消除的不良傾向，則可能是由於在注射器中的配體聚集或自我會合導致的。此時便需要重新考慮測量條件。
無法透析的小分子配體，可透析後將高分子加至透析外液溶解配體。但溶解涉及添加劑和鹽類成分的樣品（合成胜肽、合成核苷酸等）需要小心。溶解後，使用pH表檢查溶液pH。如果配體溶液的pH較緩衝液偏移超過0.05，則應用極少量HCl或NaOH溶液調整pH。鹽濃度引起的熱變化可透過控制實驗扣除。
使用含有質子解離基的小分子配體，即便濃度為數mM，若緩衝液為10mM且濃度無太大差異，緩衝能力不足會影響pH，要注意。
隔天….
透析完成。濃度調整OK！無pH偏移。樣品安裝完畢，進行測量！
控制實驗稀釋熱穩定。樣品測量後半期集中於稀釋熱的數據也獲得！透析果然重要！接著進行分析
擬合良好！KD為6nM，結合比為1.8。
仲村先生，獲得了不錯的數據。
是的，重新意識到透析的重要性！
確實如此。仲村先生，這次控制數據如何扣除呢？
根據手冊，扣除生數據。
是的。
補充說明。手冊建議控制實驗數據扣除生數據。稀釋熱一致且控制實驗中噪點多時，可用平均值扣除。視情況選擇。
進行測驗。此圖為扣除控制生數據的數據。分析上有什麼問題？
擬合不佳？
是的，為何擬合不佳呢？
因為模型錯誤？
不是模型問題。哪部分擬合特別差？
測量後半的平臺區域？
是吧，為什麼呢？
…我不知道。
擬合時，分析軟體在計算時熱量應趨於零。此數據的測量數據高於零，而擬合的紅色線最終趨於零。
哦，確實如此！
為什麼扣除了控制後測量不為零呢？
控制實驗和樣品測量稀釋熱差異，控制實驗熱發量大，扣除後為正？
是的，這種情況下如何分析？
嗯，不知道。
如果稀釋熱無法良好扣除而得到此數據，可編輯數據使其遞減於零分析曲線後。
久未公開的招數？怎麼做？
Y Translate功能很方便。
Y Translate？
字面上，移動Y軸上的值。操作資料請參考。
Y Translate操作資料，請在文章底部的表單中填寫必要項目並下載。
是的，謝謝。
分析軟體需要適應…沒有更詳盡的手冊嗎？
是的，有的。Malvern官網（英文版）可下載PDF文件（需Malvern網站帳號）。
提供解析示例具體指南。所有數據已保存在供貨電腦中，同時亦介紹所使用的擬合公式，請參見。
完成Y Translate。擬合應更好..
後半滴定的數據偏差有所降低！
仲村先生，這樣理解進一步加深了嗎？
是的！
仲村先生，這次使用了什麼緩衝液呢？
抗體製作時使用了磷酸緩衝液，ITC測量亦使用。
所以仲村先生，這裡有問題。pH相同緩衝液成分不同，會得相同數據嗎？
哦！？
例如這次是磷酸緩衝液，用相同pH的HEPES或Tris會怎樣？
嗯，由於更換緩衝液會改變結果，應有不同的結果…
正確，日語簡易手冊中有提示。
真的嗎？
看P.5.緩衝液成分部分。
啊，確實。緩衝液具有不同質子化焓值。然而，實際有多大差異？
測量一段落，我們吃些茶聊聊吧？（詳情請見深田博士專欄3）
好的！謝謝您，深田博士！！
