卡路里計測大師之路 Vol.4

接下來嘗試測量蛋白質和化合物。因為尚不清楚親和力，所以將蛋白質設為10 μM，化合物設為100 μM，按常規方法進行測量。

沒有畫出S形曲線。我是不是設錯了濃度……控制的稀釋熱每次滴定中幾乎相同。DP值為0.015 μcal/sec，故數值很小。而且比樣品最後滴定時的熱量要小。也就是說，樣品的產熱量非常小。僅是減去這個值就好嗎……

仲村，你好像有麻煩。

深田老師，是的。我測量了蛋白質和化合物，但似乎未能畫出S形曲線，而且得到的熱量非常小。

是啊。仲村，你在測量前試過使用模擬軟體嗎？

哦，是您以前提到的附屬於iTC200控制軟體的那一個。抱歉，我沒有用過……

手冊上有記載。你可以看看P.39。

好的，我會確認一下。

而且，此次測量的樣品似乎親和力較弱。

是的。我認為大約是幾微米。

濃度設置是怎麼安排的？

我將蛋白質設為10 μM，化合物設為100 μM。

那麼，假設K_D為5 μM，來模擬看看會怎麼樣？

啊，已經畫出S形曲線了。但濃度較我使用的設置要高。

是的。這是模擬軟體推薦的測量濃度。那么，仲村，你用自己的濃度設置模擬來看會怎樣呢？

蛋白質是10 μM，化合物是100 μM……

噢！沒有畫出S形曲線！！

對，如此一來，如果提前知道預測的K_D，在進行實際測量前就用這種方式模擬並確認會是有益的。

原來如此。模擬軟體真方便！

那麼，這裡有個問題。這是Bovine Carbonic Anhydrase與其相互作用的小分子，Sulfanilimide和AMBSA分別通過ITC測量的數據。看看這些資料，你有什麼想法？

上面的Sulfanilimide圖似乎略顯S形，但下面的AMBSA圖則更像直線，似乎未能形成S形曲線。

是的。那麼，為了形成S形曲線，你覺得該如何進行？

嗯……剛剛是因為濃度降低而無法形成S形曲線，所以提高濃度應該可以吧？

沒錯。順便說一下，Sulfanilimide的K_D大約是8 μM，AMBSA則是10 μM。

可以模擬下看看。

先前的濃度圖設定的濃度不足以描繪完整的S形曲線，但老師，模擬結果顯示細胞的濃度設置得較高。若無法調配出這個濃度該怎麼辦？

仲村，你還記得C值設定的範圍嗎？

設定範圍？

看看手冊上寫了什麼。大概在哪個範圍內是理想的呢？

啊！5～250是理想範圍，1～1000則為允許範圍。（請參閱簡易日文手冊P.7～8）

是的。模擬軟體中也可以更改C值。另外，你也可以模擬看看實際調配的樣品濃度進行測量會怎樣。

原來如此！這就是實驗設計。

沒錯。那麼仲村，今後可能會測量更低親和力的化合物，我會告訴你這些測量和解析的重點。

好！請指教！！

看看這份數據，仲村你有何想法？這是蛋白質和片段的相互作用……

沒有形成S形曲線，那要提高濃度來測量，不對嗎？

如果這次實驗的細胞濃度為蛋白質30 μM，片段為3 mM，結果會怎樣？

啊？片段的濃度竟如此高？而細胞的蛋白質濃度卻不算高……

再看看手冊吧。 請參考P.9 。這是針對親和力弱於100 μM的實驗設計。

沒有畫出S形曲線呢。

沒錯。當親和力非常弱時，若想畫出S形曲線，濃度設置往往會出現偏差的可能性。你可以模擬測試一下。

哇！絕不可能有1 mM的蛋白質！！

是的。因此在這種情況下，如同手冊所述，要將蛋白質的濃度設定為預期K_D的1/5至1/100，同時確保至少10 μM，滴定樣品則設定為K_D的10至50倍，約數mM，並確保在測量的後期滴定時能達到蛋白質完全飽和的條件。請看看之前數據的標準化繪圖，從橫軸上的摩爾比中可以看出出現了一個大值，對嗎？

是的。但這樣還不能形成S形曲線……

是的。現在這種狀態下，無法求得結合比分子還有焓變。因此需要在解析中增加一點巧妙之處。

巧妙之處？？

是的。如手冊中所述，需假設”結合比值”來進行解析。如果測量的樣品顯示出1:1的結合，那麼結合比理論上可以認為是”1″。 哦，理論上是……

扎合比位於S形曲線的中點，因此在進行擬合時可以在初始值中作為常數給定”1″，這樣發揮擬合功能。實際操作中，當Fitting Session窗口出現時，向N的Value中輸入”1″，並取消表示變化的”Vary?”的勾選，即可將其設為常數。這樣解析軟體便能夠將獲得的曲線作為S形曲線的一部分使用，把摩爾比為1的地方作為拐點來模擬S形曲線。最終可以求得K_D和ΔH。

真不錯！

然而，需要注意的是，這裡假設樣品濃度維持100%活性。 是的！

於是仲村便能進行真實樣品的測量。他理解到不同樣品的特性所需相應的樣品準備、測量條件，以及解析方法。他學會了在出現非正常反應時，不要強行解析，而是分析出該從何種角度了解它應該的呈現，並探索未如預期時可能的原因。下一次，我們將討論出現非正常數據時的解釋及應對方法。

【博客後記】
你覺得在ITC諮詢中哪個問題最多？答案是“滴定注射器在清洗時溶液無法流動”。關於此處理方法，我們已在卡路里計量大師之路vol.2中提到。

注射器玻璃部的損壞、充電口轉接頭的連接不良、O型環的老化等常被提及，但最近還出現了其他原因導致了故障。

那是位於洗滌模塊背面的過濾器阻塞。

更換此過濾器即可解決部分故障。如按”MicroCal iTC200滴定注射器清洗水無法流動時的應對方法”指示未能解決，可試更換此過濾器。同時，過濾器已隨系統供貨。

僅是由於系統交付時期不一，某些過濾器安裝於洗滌模塊內部，可能並不顯示於圖片中，若遇此情況，敬請聯絡我公司技術支持。