原始反應混合物的篩檢

簡介

片段篩檢已成為藥物發現過程中識別初始活性化合物的有效方法。主要特色為篩檢小數目 (1000) 之低分子量 (通常小於 250 Da) 化合物，以與標的物鍵結。較小型的化合物代表它們較有可能鍵結，但具較弱的親和力，且有許多不同的生物物理方法可使用，包括 Creoptix 感測器。識別鍵結至大多數標的物之大多數鍵結位置的片段是相對直接的。在開始對藥物屬性進行最佳化之前，主要挑戰是在將片段增長至具較高親和力的大活性化合物。

假設化合物 (分析物，A) 鍵結至標的物 (配體，L) 的親和力為一簡單平衡如下：

其中 k_d 是解離或解離速率，k_a 是結合或結合速率，平衡解離常數或親和力 (K_D) 為 k_d/ k_a 的比率。在許多情況下，當修飾化合物導致解離速率變慢時，則會發生親和力改善。此為一級速率常數，因此與濃度無關。

傳統的最佳化方法需要個別反應來合成每種化合物，隨後以定義好的濃度來純化和製成化合物，再於測定方法中量測親和力。Vernalis 率先開發出一種篩檢原始反應混合物 (CRM) 的方法，大幅改善合成的速度與成本，以探索改善化合物親和力的機會。對於活性化合物而言，通常會以孔盤形式平行執行一組反應，變更加入到活性化合物的替代物。在少量作業後，產生的原始反應混合物會個別進行評估其鍵結至標的物之解離速率上的改變–解離速率上的變化表示已達到較佳親和力的化合物。此解離速率篩檢 (ORS)¹ 的初步示範使用了 Biacore 技術，展現其在材料、相關廢棄物處置和時間等方面的有效改善。此外，在對結構活性關係 (SAR) 了解不多的情況下，可在專案早期階段快速排定更多化合物。

此方法之關鍵在於能夠可靠偵測解離速率的變化。專有的光柵耦合干涉 (GCI) 技術能提供較傳統技術，如表面電漿共振 (SPR)，更高的靈敏度，並能可靠測定高達 10s^-1 的解離速率。此外，Creoptix WAVE 的無阻塞微流道可適用於各種溶劑，包括乙腈和高濃度 DMSO，增加可用於原始反應混合物的化學品範圍。

在本技術說明中，我們將以 Creoptix WAVE 取得的 ORS 結果與 Vernalis 先前使用 Biacore 儀器所得之結果進行比較，回溯使用相同的 CRM 資料庫來對照兩項標的物：丙酮酸脫氫酶激酶 2 (aa16-407)，以下簡稱為 PDHK2 及熱休克蛋白 90α 之 N 端 ATP 酶 (aa9–236)，以下簡稱為 Hsp90。Vernalis 先前已識別出一系列 GHKL 家族 ATP 酶中這兩個成員的強效抑制劑。^2，3，4

材料與方法

原始反應混合物 (CRM) 的解離速率篩檢。在 WAVEdelta 上篩檢八十三 (83) 個 CRM 和一個純化對照化合物，以了解其解離速率。PCH-NTA WAVEchip 在擷取標的蛋白質之前，PCH-NTA WAVEchip 晶片上載有氯化鎳。然後在 ca. 7000 pg/mm² 下分別在通道 2 和 3 上擷取雙重 His6 標記的 HSP90 和雙重 His6 標記的 PDHK2 蛋白質。通道 1 和 4 載滿鎳，作為參考通道使用。在 HBS-P +1%DMSO 中注入約 20 μm 濃度的 CRM，以 250 μl/min 之固定流速持續 30 秒。允許解離 120 秒。使用 WAVEcontrol 軟體執行解離速率測定。

純化化合物動力學

擷取蛋白質前，PCH-NTA WAVEchip 載有 0.5 mM NiCl²。在 ca. 3500 pg/mm2 密度下於 HBS-P 緩衝液中擷取 HSP90 和 PDHK2。VER235377 (純化化合物) 在 HBS-P + 1%DMSO 中以 30 μl/min 之速度進行注入，濃度範圍從 27.4 nM 到 20 μM 持續增加 (7 個濃度，3 倍稀釋)。60 秒解離階段前，允許注入 60 秒。所有交互作用分析於 25°C 下執行，並使用 WAVEcontrol 評估數據。使用 Langmuir 1:1 模型進行數據擬合，並判定動力學參數。

結果

Vernalis 率先在活性至先導化學物領域使用解離速率篩檢 (ORS) 來進行樣品的動力學分析。¹ 他們在化學資訊學、化合物資料庫合成和表面電漿共振 (SPR) 分析方面的專業，為這項標竿研究所吸引並促成了未純化反應產物 (CRM) 的 ORS。CRM 篩檢能快速識別來自活性片段的先導化合物，而不需純化化合物資料庫或使用蛋白質結構。一項比較性的 ORS 研究，使用了 WAVEdelta (基於 GCI 技術) 與 Biacore T200 (基於 SPR 技術) 來對兩項技術進行比較。具體而言，選定的化合物是在 WAVEdelta 上進行量測，並與 Vernalis 的 CRM 資料庫所進行的回溯測試進行比較 (在 Biacore T200 上)。 

圖 1 顯示測定選定 CRM 解離速率之範例。在這兩項實驗中，從 Creoptix WAVEdelta 所獲得的結果均與 Biacore T200 獲得的結果一致。對於解離速率大於 1s^-1 的化合物來說，WAVEdelta 能可靠分離那些非常快速解離的常數 (k_off)。

圖 1：選定 CRM 的解離速率篩檢。量測是在 Biacore T200 (左側圖形) 或 Creoptix WAVEdelta (右側圖形) 上完成。GCI 數據會重新產出 SPR 數據，並且能更準確、更可靠地測定比 1s^-1 更快的交互作用

此解離速率篩檢研究測定出相同的 PDHK2 選擇性活性化合物，其在 WAVEdelta 上亦被分析出純化化合物 (VER235377) 之特性。動力學參數和鍵結親和力與基於 SPR 的 Biacore T200 所獲得結果相似。圖 2 顯示由 GCI Creoptix WAVEdelta (右側圖形) 和 SPR (Biacore T200，左側圖形) 所取得的數據。最後，我們發現了相同的 PDHK2 選擇性活性化合物 (VER235377)。^2，4 得到的動力學數據如表 1 所示。

	kon (M-1.s-1)	koff (s-1)	Rmax (pg/mm2)	KD (nM)
HSP90 Biacore T200	1.92x105	0.130	24.1	679
HSP90 WAVEdelta	1.82x105	0.122	25.2	669
PDHK2 Biacore T200	6.10x105	0.116	18.3	191
PDHK2 WAVEdelta	3.16x105	0.052	14.5	166

表 1：在 HSP90 和 PDHK2 上所得到純化化合物 VER235377 的動力學數據

圖 2：純化化合物 VER235377 的鍵結動力學數據。量測是在 Biacore T200 (左側圖形) 或 Creoptix WAVEdelta (右側圖形) 上完成。在 HSP90 和 PDHK2 兩種蛋白質所取得的數據相當近似

簡而言之，我們在使用 Creoptix WAVE 下能夠：

• 確認先前發表及量測的 Biacore T200 PDHK2 活性化合物^2，4
• 確認相同的 PDHK2 選擇性活性化合物 VER235377，並能以其完全純化的形式進行特性分析
• 確認 VER235377 PDHK2 之選擇性超過 HSP90
• 在解離速率高於 1s^-1 的化合物呈現絕佳的解析，顯示出 Creoptix WAVE 具備分離快速解離速率的能力

結論

Creoptix WAVE 提供與 Biacore T200 量測結果一致的絕佳動力學數據，如同回溯測量 Vernalis 化合物活動針對丙酮酸脫氫酶激酶 2 (PDHK2) 及熱休克蛋白 90 (HSP90) 所獲得的結果所示。憑藉高靈敏度、可分離極快速交互作用之能力，Creoptix WAVE 可改善小分子的化合物篩檢和動力學分析、加速藥物開發，並大幅降低與標的物和化合物純化相關的成本。因此，WAVE 最適合用於弱鍵結之篩檢資料庫，其表現出非常快速的解離速率，例如小分子、片段、胜肽等。加上無阻塞的微流道技術，可對原始、未純化反應混合物進行研究，WAVE 具革命性並可加速藥物發現過程。

關鍵要點

使用 Creoptix WAVEsystem，可在原始反應混合物中擷取快速解離速率的弱鍵結化合物。

• 與原始反應混合物相容的無阻塞微流道：適合用於解離速率篩檢和基於片段的藥物設計
• 與 SPR 歷史數據相容的數據：GCI 技術可提供近似於使用 SPR 型儀器所取得的動力學數據
• 可分離高於 1 s^-1 的解離速率：可快速切換，WAVEsystem 系統可測量高達 10 s^-1 的解離速率

適合：

• 原始混合物的解離速率篩檢：小分子、碎片及胜肽
• 加速活性化合物至先導化合物的進展
• 先導化合物最佳化

參考文獻

1. Murray, J.B. et al.2014.Off-Rate Screening (ORS) By Surface Plasmon Resonance.An efficient method to kinetically sample hit to lead chemical space in unpurified reaction products.J. Med.Chem.57, 2845-1850 doi: /10.1021/jm401848a
2. Brough, P.A. et al.2017.Application of Off-Rate Screening in the Identification of Novel Pan-Isoform Inhibitors of Pyruvate Dehydrogenase Kinase.J.Med.Chem., 60, 6, 2271–2286. doi: 10.1021/acs.jmedchem.6b01478
3. Brough, P. A. et al.2009.Combining hit identification strategies: fragment-based and in silico approaches to orally active 2-aminothieno[2,3-d]pyrimidine inhibitors of the Hsp90 molecular chaperone.J. Med.Chem.52, 4794–4809 doi: 10.1021/jm900357y
4. Baker, L .M. et al.Rapid optimization of fragments and hits to lead compounds from screening of crude reaction mixtures.Commun Chem 3, 122 (2020).doi: 10.1038/s42004-020-00367-0

致謝

我們感謝 Natalia Matassova (Vernalis) 博士完成所有的實驗以及 Roderick Hubbard 教授為此技術說明做出之貢獻。