利用新穎 waveRAPID 動力學測定，突破醫藥活性化合物開發的界限

摘要

藥物發現高處理量的篩檢活動涉及數千種化合物，可產出大量與藥物標的表現出潛在交互作用的活性化合物。鍵結親和力可從許多高處理量測定法的穩定狀態分析中得出。若要選擇具進一步發展潛力的活性化合物，則需要完整的鍵結動力學特性分析。這才能辨識出具較佳動力學鍵結率的化合物，將其帶到預期標的物上。實際上，這便代表必須對大量篩選中的活性化合物進行廣泛的動力學研究。到目前為止，這是一項極為耗時且耗材的工作。必須為數百種活性化合物準備適當的連續稀釋，且每個濃度都必須重複注入。Creoptix 開發出一種新穎的技術，可讓這類專案更有效率，以單一濃度便能自樣品進行可靠的動力學特性分析。Creoptix WAVE 上的 Creoptix waveRAPID 代表篩檢環境下動力學量測變化之範例。

在目前的研究中，由我們的客戶 Idorsia Pharmaceuticals Ltd 下的 HTS 藥物發現團隊所執行，我們證實了 WaveRAPID 的強大效能，可簡化大量藥物活性化合物的動力學特性分析。在數項實驗中，waveRAPID 已測定出高達 146 種活性化合物的鍵結動力學，使用單一濃度樣品脈衝注入至預先固定在感測器基質上的藥物標的。所有經分析的化合物，均已在最先進的 SPR 儀器上進行研究，使用傳統多循環動力學量測。 

透過比較這兩項技術所取得的數據，顯示計算出來的解離常數 (K_D) 具絕佳相關性且僅存在少數離群值。此發現驗證了 Creoptix WAVE 的 waveRAPID 科技在早期藥物發現的應用，能在篩檢環境下以高處理量產出深入的動力學數據。由於為每種化合物進行特性分析的時間縮減至僅需數分鐘，因此可大幅節省時間與材料。與目前最先進的 SPR 儀器相比，可在數天內進行數百種化合物的大型活動來判定鍵結動力學，無需用到數週的時間。 

此外，即便是高難度的化合物，waveRAPID 技術亦可在整個測定系列中產出可靠的數據 (例如顯示出大量折射率作用或緩慢的解離)。這類化合物通常會需要表面再生和重新固定配體蛋白質。此會在使用傳統多循環測定的較大型量測活動期間中斷工作流程。最後，Creoptix WAVE 以及新穎的 waveRAPID 方法可以非常直觀的方式設定測定，自每個樣品的單一濃度提供完整的鍵結動力學分析。此外，Creoptix 根據統計參數估計而來的獨特新穎評估引擎，Direct Kinetics，能提供自動化且可靠的分析工作流程，包括真正的統計誤差計算。waveRAPID 技術與 Direct Kinetics 自動化評估引擎是一套強大的套件，具備將現今早期藥物發現所執行之動力學鍵結分析方式轉型的潛力。

材料與方法

Creoptix 實驗室指南

以組胺酸標記的標的蛋白 1 和組胺酸標記的標的蛋白 2，會在預先載入 Ni²⁺ 離子的 4PCP-NTA WAVEchip 晶片上進行擷取，密度為 4000 至 5000 pg/mm²。化合物的脈衝式 waveRAPID 注入，是從 10 μM 樣品溶液中進行 25 秒，接著注入緩衝液 250 秒，每個流動式樣品載台的流動速率為 32.5 μl/min。所有測量均使用 0.05% Tween-20 及 5% DMSO 在 50 mM 磷酸鹽緩衝液中進行。透過減除參考通道和空白注入的訊號對資料進行雙重參照。感測區經過 6 次注入脈衝後所表現的化合物濃度，是以脈衝注入電泳緩衝液加上額外 0.5% DMSO 來進行校正，使用與化合物樣品相同的注入參數。動力學分析是由 Direct Kinetics 估計引擎使用 1:1 鍵結模型來執行。

Biacore 實驗室指南

在預先以 Ni²⁺ 離子活化的 Ni-NTA 晶片上擷取以組胺酸標記的標的蛋白 1 和組胺酸標記的標的蛋白 2，密度為 4000 至 5000 pg/mm²。分析物在電泳緩衝液 (50 mM 磷酸鹽緩衝液與 0.05% Tween-20 和 5% DMSO) 中，透過一序列稀釋將分析物調整至所需濃度。以 100 秒的結合時間、250 秒的解離時間、40 μl/min 的流動速率來取得關聯圖。為了測定鍵結動力學 (k_on、k_off 和 K_d)，在雙重參照後取得的感應圖是使用 1:1 鍵結模型由 Biacore T200 評估軟體來進行分析。

結果

此項新穎的 waveRAPID 技術，可在類似篩檢的環境下快速擷取動力學鍵結資料，並已根據最先進的儀器和本研究中的方法進行驗證。如圖 1 所示，透過單一濃度每份樣品的脈衝注入，可為大量篩檢中的活性化合物快速產出動力學鍵結資料。包括分析物的解離，每項量側僅需約 5 分鐘。圖 1 的圖形 A 及圖形 B 顯示 waveRAPID 所產生的典型反應分析結果 (數據顯示為紅色，動力學 1:1 模型顯示為黑色)。經評估之參數顯示在圖形 C 的速率圖中 (黑色圓圈中為整個測定中注入的對照化合物)，展現絕佳的再現性。表 1 列出典型測定時間和樣品處理量，使用 384 個樣品與示範測定在兩個標的物上進行比較。 

圖 1：使用新穎的 waveRAPID 技術，在早期藥物活性開發及特性分析上進行 Creoptix WAVEdelta 的 GCI 應用。完整的動力學特性分析可在篩檢環境下使用 waveRAPID 以單一濃度注入化合物來達成，為早期藥物活性開現節省大量時間和成本。
(a) 呈現從 80 種化合物篩檢中選取具代表性的 waveRAPID 反應分析結果。
(b) 使用 WAVEcontrol 可選擇預設中的自訂注入設定，可涵蓋整個親和力範圍。在此使用的是中度鍵結之設定 (20 秒脈衝注入，250 秒解離)，親和力的解析值可自相當低的奈米莫耳至相當低的微莫耳。
(c) 動力學速率顯示速率圖上，對角線上具有相同的親和力。圓圈內的數據點顯示對照化合物在整個測定上具絕佳的再現性。

表 1：示範測定法的執行時間和樣品處理量，比較 WAVEdelta 的 waveRAPID 和最先進的技術 (Biacore T200，8k)，以取得 384 個樣品在 2 個標的物上的完整動力學特性分析。

測得的動力學數據會針對鍵結率上的誤差進行篩選 (低於絕對 k_A 的 100% 且低於絕對 k_d的 50%)，並與標準 SPR 多循環測量之數據進行比較。如圖 2 所示，與傳統 SPR 多循環測量比較的結果顯示兩個資料組之間的相關性極佳。 

圖 2：使用 waveRAPID 在 Creoptix WAVEdelta 上進行藥物篩檢活性鍵結動力學之量測，會根據在 Biacore T200 儀器上所執行之傳統多循環動力學量測所測得的值來繪製。waveRAPID 數據已經篩選以取得低於計算出來速率參數 100% 的結合速率 (k_a) 和且低於計算出來速率參數 50% 的解離速率 (k_d) 之統計誤差。相關性可驗證 waveRAPID 動力學方法較傳統方法更快速十倍。

為了進一步挑戰該系統，在整個測定過程中亦執行了另一系列的量測，包括在傳統多循環量測中會造成工作流程中斷和表面再生的困難化合物。推測是因為分析物與標的蛋白的接觸時間顯著縮短，這些困難的分子 (顯示大量反應或緩慢解離) 並不會中斷 WAVE 的整體工作流程，且並不需要進行任何間歇的表面再生。如圖 3 所示，仍能可靠評估近乎所有感興趣化合物的動力學鍵結參數，且具低誤差，陽性對照仍展現高度可再現性。

圖 3：再次於測定中對先前進行過特性分析的三十個化合物進行測量，同時包含 30 個呈現大量折射率 (RI) 作用或緩慢解離、較具挑戰性的化合物，並在整個測定過程中注入具有挑戰性的化合物。具挑戰性的化合物會在傳統多循環動力學中造成大幅工作流程限制，因此需要定期進行表面再生，waveRAPID 可透過連續無人看管的量測時間來實現無縫工作流程。由 Creoptix Direct Kinetics 估算引擎所判定的絕對計算結合率和解離率常數的統計誤差百分比，會分別繪製在水平和垂直軸上。先前測定中未出現困難行為的化合物 (綠色標記)，以及重複的對照化合物 (紫色標記)，均可透過低誤差明確辨識。此外，由於大量折射率作用而在先前測定中出現困難的化合物，也可以大量在 WAVE 上進行分析且具低誤差 (藍色標記)。其餘難以分析的化合物可透過較大誤差明確識別 (紅色標記)。

結論

相較於傳統多循環動力學測定，WAVEsystem 系統憑藉高靈敏度、分離極快速交互作用之能力及 waveRAPID 測定技術，明顯能在較短時間內，對大量藥物活性化合物進行動力學特性分析。透過單一孔中的單一注入所取得之動力學資訊，可大幅減少試劑和樣品之消耗，對早期藥物發現助益良多。此外，waveRAPID 可提供：

• 以更短時間取得可比擬傳統 SPR 的結果
• 縮短接觸時間、保護標的蛋白、實現更長且不間斷的測定
• 高再現性的可靠結果
• 鍵結動力學資訊來自單一注入，可根據相關參數選擇活性化合物
• 數天內便能對更多交互作用進行特性分析，無需數週
• 深度統計誤差計算，可找出相關活性化合物並篩檢出有問題的化合物

關鍵要點

• 縮短樣品接觸時間，可保護標的物完整性，持續運作更長時間
• 來自單一注入的鍵結動力學
• 具再現性且可與傳統 SP 比擬之技術

適合：

• 篩檢原始混合物：小分子、片段和胜肽
• 加速活性化合物至先導化合物的進展
• 先導化合物最佳化
• 不穩定的標的物
• 困難的化合物
  

致謝

我們感謝 Geoffroy Bourquin、Laksmei Goglia、Solange Meyer 及 Oliver Peter 完成所有的實驗並為此文章做出之貢獻。