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por Verna Frasca, Tuesday, 19th March 2019

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Melhores Práticas para Calorimetria de Titulação Isotérmica para estudar interações de ligação – Parte 3

Aqui estão várias melhores práticas para realizar experimentos de ligação tradicionais com os sistemas MicroCal PEAQ-ITC, VP-ITC e iTC200. Esta é uma continuação dos blogs anteriores ‘Melhores Práticas para Calorimetria de Titulação Isotérmica para estudar interações de ligação’ parte 1 e parte 2.

Realize verificações regulares de desempenho e validação no seu ITC

  • Injeções de água em água
  • Kit de teste ITC com RNase e EDTA
  • Outro ensaio de ligação de referência

Antes dos experimentos de ligação, realize titulações de controle sempre que possível

  • Verifique calores de diluição e outras fontes de variação de calor
  • A titulação de controle típica é o ligante na seringa ITC, titulado em tampão correspondente, usando os mesmos parâmetros experimentais do ITC do experimento de ligação
  • As variações térmicas para a titulação de controle devem ser pequenas, reprodutíveis e semelhantes às variações térmicas no final do experimento de ligação (Figura 1, topo)
  • Outras titulações de controle são tampão em tampão e tampão em macromolécula na célula do ITC

Figura 1: (topo) Dados brutos do ITC, com a titulação de controle (ligante em tampão) (vermelho) e o experimento de ligação (ligante em macromolécula) (preto). Note que os picos para a titulação de controle são similares em forma e tamanho às injeções finais do experimento de ligação.

(Abaixo) Mudanças térmicas normalizadas, com a titulação de controle (vermelho) e o experimento de ligação (preto). Os dados são ajustados para o modelo de ligação de um conjunto de sítios.

Avaliação dos dados brutos do ITC: como são os dados brutos para um experimento ideal de ITC para um evento de ligação (1:1)

Veja as figuras 1 e 2.

  • O gráfico de dados de titulação começa como uma série de picos grandes, aproximadamente iguais (exotérmicos ou endotérmicos), representando quase 100% de ligação do ligante à macromolécula
  • As variações térmicas se reduzem à medida que os sítios de ligação são saturados com mais injeções de ligante durante o experimento
  • Os picos finais, correspondendo aos calores de diluição do ligante após a saturação total da ligação, devem ser pequenos e reprodutíveis (Figuras 1 e 2)
  • Esse tipo de curva de titulação resultará em uma isotermia de ligação sigmoidal (Figura 1 abaixo)
  • É necessário uma mudança de calor suficiente acima do ruído de base para dados de ITC de alta qualidade
  • Calores de injeção (área integrada):
    • Para PEAQ-ITC e ITC200: >2.5 ucals para o segundo pico (primeiro completo) é ideal
      • ~1 ucals para o segundo pico é o calor mínimo para análise de dados
    • Para VP-ITC: >10 ucals para o segundo pico (primeiro completo) é ideal
      • ~3-5 ucals para o segundo pico é o calor mínimo para análise de dados
    • Abaixo desse intervalo de detecção de calor, os dados podem ser mais ruidosos devido à menor relação sinal/ruído
  • A posição da linha de base (em ucal/sec) para os dados brutos de ITC deve estar dentro de 1 ucal/sec da configuração de potência de referência. Se a diferença for maior que 1 ucal/sec, isso pode indicar uma célula de ITC suja e/ou bolhas na célula de referência ou de amostra
  • Todos os valores DP (eixo Y) para os dados brutos de ITC devem estar acima de 0 ucal/sec
  • A posição da linha de base pós-injeção deve ser a mesma que a linha de base pré-injeção. Se não for, pode não haver tempo suficiente entre as injeções, ou existe outro processo causando uma mudança em DP, como hidrólise enzimática
  • Um ligeiro desvio na linha de base ao longo da titulação é normal. Se houver uma linha de base de integração boa, os dados estão OK (Figura 2). Você não quer grandes saltos na linha de base, ou “degraus


Figura 2. Dados de ITC de alta qualidade. Note o ligeiro desvio na linha de base de integração (em vermelho) – isso é aceitável.

Mais informações sobre o valor de N do ajuste de curva de ITC

N está associado à concentração total de macromolécula e é um dos parâmetros determinados durante a análise dos dados. É importante entender que o valor de N do ITC NÃO é sempre o mesmo que a estequiometria (relação de ligação) da ligação do ligante à macromolécula. O valor de N de fato equivale à estequiometria se as concentrações usadas para o ajuste estiverem corretas e 100% ativas.

Outra forma de expressar o valor de N é esta equação:

N = St x [AFcell/AFsyr]

Onde St é a estequiometria (número de sítios de ligação que a macromolécula possui para o ligante), AF é a “fração ativa” da biomolécula (a concentração ativa dividida pela concentração total), AFcell é a fração ativa da amostra na célula (tipicamente a macromolécula), e AFsyr é a fração ativa da amostra na seringa (tipicamente o ligante).

Qualquer um dos três valores nesta equação pode alterar N, o que significa que N é uma medida da relação de ligação tanto quanto da atividade da(s) amostra(s). Dois destes valores devem ser conhecidos (ou assumidos) para se obter o terceiro. Por exemplo, se alguém está interessado na estequiometria, então as concentrações fornecidas no ajuste devem ser precisas e 100% ativas. Se alguém está interessado na atividade da amostra na célula (frequentemente a macromolécula), então a estequiometria e a concentração ativa da amostra na seringa (ligante) devem ser assumidas.

No pacote de software de análise de dados do PEAQ-ITC, você também pode ajustar os dados fixando N em 1 (ou no valor desejado) e variando a concentração na célula ou na seringa.

Se N for menor que a estequiometria esperada, a concentração ativa de macromolécula na célula é menor que a concentração total, e/ou sua concentração ativa de ligante é maior que a concentração total.

Se N for 0.5, é possível que sua macromolécula (na célula ITC) seja um dímero e ligue um ligante por dímero. Também é possível que sua biomolécula na seringa tenha 2 sítios de ligação, e a amostra na célula tenha um sítio de ligação, então você deve tentar ajustar a curva de ligação usando a opção “ligante na célula”.

Se N for maior que a estequiometria esperada, a concentração ativa de macromolécula na célula é maior que a concentração total, e/ou sua concentração ativa de ligante é menor que a concentração total.

Erros na concentração de ligante na seringa resultam em erros de medição de N, KD e ΔH, e, portanto, na energia livre calculada (ΔG) e na contribuição entrópica (-TΔS) para ligação. Erros na concentração de macromolécula na célula afetam principalmente a precisão do valor determinado de N.

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