Técnicas de Avaliação de Propriedades Físicas no Desenvolvimento de Biofármacos: Seleção de Candidatos

Apresentamos os itens a serem avaliados em cada estágio do desenvolvimento de biofármacos e as técnicas de medição da Malvern Panalytical que permitem essas avaliações. Nesta página, apresentamos detalhes sobre a “Seleção de Candidatos”.

Determinação do Tamanho de Partículas e Avaliação de Agregados e Associações por Distribuição de Tamanho de Partículas (DLS)

Medição do Tamanho da Globina

É importante rastrear o amostra desejada rapidamente e de maneira prática a partir de muitos candidatos. O método de espalhamento de luz dinâmico (DLS) permite determinar rapidamente o tamanho das partículas de amostra e o estado de dispersão em questão de minutos, facilitando a identificação de associações e agregados. O gráfico abaixo apresenta no eixo horizontal o tamanho (raio hidrodinâmico) e no vertical a distribuição de intensidade de luz (%), medindo a distribuição do tamanho de partículas de várias globinas. A tabela mostra que os picos de intensidade de espalhamento de HbA (azul) e Hemocianina (preto) com valores de referência de 100% são únicos. Por outro lado, Rice Hb1 (verde) e Polytaur (cinza) com valores mais baixos apresentam uma distribuição ampla de tamanho, indicando a presença de moléculas de maior tamanho.

Assim, utilizando DLS, podemos determinar o tamanho das partículas e analisar as proporções de monômeros, dímeros e oligômeros superiores no amostra através da razão de área de pico. Além disso, o DLS permite estimar o peso molecular a partir das informações de tamanho de partículas, sendo eficaz para determinar o estado oligomérico e a proporção de agregados presentes no amostra.

Avaliação Precisa do Peso Molecular e Informação Estrutural Utilizando Múltiplos Detectores (SEC-LS・Vis)

Avaliação de apo-RD e holo-RD

Os métodos de análise tradicionais baseados na capacidade de retenção de materiais padrão podem levar a julgamentos errados quando o volume aparente da proteína aumenta devido a alterações estruturais, resultando em diferentes pesos moleculares. Conectar detectores de espalhamento de luz (LS) à cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e realizar análises de luz dispersa é eficaz para buscar pesos moleculares precisos. O gráfico abaixo apresenta o que acontece com a proteína do domínio Repeat in Toxin (RD), que muda de estrutura ao se ligar a íons Ca, medida em SEC com e sem CaCl₂ (holo/apó). Ao comparar os estados holo (linha sólida) e apó (linha pontilhada), no estado apó o tempo de eluição é mais rápido, o que pela técnica convencional indicaria que seu peso molecular é cerca de 600 kDa enquanto o holo seria de 73kDa, sendo interpretado que o apó está em estado de agregação. Contudo, a análise por espalhamento de luz confirmou pesos moleculares similares de aproximadamente 73kDa para ambos. Além disso, a viscosidade intrínseca obtida pelo detector de viscosidade revelou diferenças notáveis, com 0.35 dL/g para apó e 0.055 dL/g para holo, indicando que a presença de íons Ca causa alterações estruturais na proteína.

Assim, a medição simultânea com múltiplos detectores oferece informações precisas sobre o peso molecular e estrutura, permitindo evitar equívocos durante a seleção de construções.

Determinação do Tamanho de Partículas e Avaliação de Agregados e Associações Utilizando Múltiplos Detectores (SEC-LS・Vis)

Avaliação da Pureza dos Anticorpos

O espalhamento de luz tende a aparecer mais forte em moléculas de maior tamanho. Conectando detectores de espalhamento de luz a SEC, é possível visualizar claramente a região dos agregados, difícil de identificar com detectores RI ou UV/VIS. A imagem abaixo mostra o resultado da medição de IgG usando detectores de espalhamento de luz e RI conectados a SEC. Monômeros e dímeros são visíveis em ambos os sinais (RI vermelho, e espalhamento laranja), mas na região dos agregados, o sinal de espalhamento é mais intenso que o de RI (seta vermelha). Detectores RI e UV/VIS dependem da concentração para mudar o sinal, então os poucos agregados têm sinais naturalmente menores. A adição do detector de espalhamento permite discernir se há realmente agregações ou apenas variações de base.

Ao usar SEC-LS・Vis, é possível verificar a pureza do amostra com maior precisão, permitindo selecionar construções mais desejáveis e puras.

Seleção de Construções com Comparação de estabilidade térmica (DSC)

Comparação de estabilidade térmica de 12 variantes de anticorpos com mutações em Fab

Sabe-se que a inserção de mutações em proteínas pode alterar sua atividade e estabilidade, sendo a melhoria da estabilidade uma influência direta na atividade. A calorimetria de varredura diferencial (DSC) permite avaliar a estabilidade térmica de proteínas sem marcação. A imagem abaixo exibe dados de DSC medindo a variante selvagem (WT) e 12 variantes de Fab introduzindo mutações em um anticorpo que reconhece o toxoide tetânico. O eixo horizontal é a temperatura e o vertical é a capacidade térmica necessária para desnaturação. A T_m do pico principal para o WT Fab é de 78.7 ℃, enquanto para a variante mutada V11 é de 92 ℃, indicando que a construção V11 é estável em 13.3 ℃.

Com o uso de DSC, podemos comparar o efeito de pequenas variações na sequência da região variável de um anticorpo na estabilidade térmica, possibilitando restringir o foco para construções mais estáveis.

Seleção de Construções Baseada em Atividade de Ligação (ITC)

Interação de histona chaperona com três diferentes peptídeos de histona

No desenvolvimento farmacêutico, selecionar o candidato de maior afinidade para a proteína alvo de maneira eficiente é crucial. A calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é capaz de determinar a afinidade em interações moleculares, bem como especificidade e mecanismo de ligação em uma única medição.

A imagem abaixo compara a interação de três peptídeos de histona (10-mer) diferentes com o domínio PHD (plant homodomain) do fator associado à proteína de ligação TATA TAF3 (TBP) (histona chaperona). O gráfico superior mostra os dados brutos da medição e o inferior mostra a mudança de entalpia (△H) devido à interação em relação à razão molar no eixo horizontal. Cada uma dessas interações resulta em uma curva sigmoide única, indicando ligações 1:1 típicas, com análise de ajuste sugerindo diferenças de afinidade entre os peptídeos. A diferença de afinidade reflete a inclinação da curva, quanto mais vertical, a afinidade é mais forte; quanto mais deitada, mais fraca.

Assim, o uso de ITC permite a seleção de construções com alta afinidade.

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