Técnicas de Avaliação de Propriedades Físicas no Desenvolvimento de Biofármacos: Estudo de Formulação
Apresentamos os itens que devem ser avaliados nas várias etapas do desenvolvimento de biofármacos e as técnicas de medição da Malvern Panalytical que permitem essa avaliação. Neste página, detalhamos sobre o “Estudo de Formulação”.
Avaliação da Estabilidade de Dispersão Usando o Coeficiente de Difusão (DLS)
Comparação do coeficiente de difusão sob diferentes condições de formulação a partir da dependência de concentração de anticorpos
No caso dos biofármacos, ao plotar o coeficiente de difusão determinado por espalhamento de luz dinâmico (DLS) em relação à concentração, é possível avaliar a estabilidade de dispersão. A imagem abaixo mostra a mudança no tamanho das partículas devido à variação da concentração de IgG disperso em diferentes tampões, medida por DLS.
No tampão 1 (esquerda), pode-se verificar que quanto maior a concentração, maior o diâmetro das partículas e menor o coeficiente de difusão. Por outro lado, no tampão 2 (direita), o diâmetro das partículas diminui e o coeficiente de difusão aumenta. Isso é influenciado pela força de repulsão das interações intermoleculares, que aparentemente faz com que o coeficiente de difusão seja maior em tampão 2. A imagem abaixo é um gráfico do coeficiente de difusão em função da concentração, onde uma inclinação negativa (azul) indica baixa estabilidade de dispersão, enquanto uma inclinação positiva (vermelho) sugere alta estabilidade com menos agregados.
Assim, o uso de DLS permite a avaliação da estabilidade de dispersão em amostras sob diferentes condições de formulação.
Avaliação da Estabilidade de Dispersão Usando o Segundo Coeficiente Virial (SLS)
Comparação do Segundo Coeficiente Virial sob diferentes condições de formulação a partir da dependência da concentração da amostra
O espalhamento de luz estático (SLS), uma técnica da dispersão de luz, permite determinar a massa molecular da amostra e o segundo coeficiente virial (B22), sugerindo a estabilidade de dispersão através desses parâmetros. A imagem superior mostra a avaliação da estabilidade de dispersão de lisozima em tampões contendo diferentes concentrações de NaCl realizada por SLS. Para cada concentração de NaCl, a variação da concentração de proteína foi plotada (Diagrama de Debye) para determinar a inclinação de B22, que indica a relação entre soluto e solvente, onde B22 positivo geralmente sugere estabilidade de dispersão. Isso sugere alta estabilidade de dispersão da lisozima em tampões sem NaCl.
A imagem inferior compara B22 de um mesmo anticorpo em diferentes tampões. Os resultados mostram que a estabilidade de dispersão é maior no tampão 2.
Assim, SLS permite a avaliação de proteínas considerando a estabilidade de dispersão sob diferentes condições de formulação.
Avaliação da Estabilidade de Dispersão Usando a Eletroforese de Luz Espalhada (ELS)
Comparação do potencial zeta do anticorpo em diferentes condições de formulação
O potencial zeta, um dos indicadores de dispersão, pode ser medido por eletroforese de luz espalhada (ELS), uma técnica da dispersão de luz. O potencial zeta é confiado pelas interações entre a molécula e seu ambiente circundante (tipo de tampão). A imagem abaixo mostra a comparação dos potenciais zeta do IgG em diferentes tampões. Devido à configuração com alta concentração de sal em ELS, as medições podem se tornar instáveis, então várias medições são realizadas para confirmar a reprodutibilidade. No tampão 1 (azul), o potencial zeta é baixo, e a carga calculada pela mobilidade eletroforética (dados não exibidos) é pequena (0,8), indicando baixa estabilidade de dispersão e interação dipolar. No tampão 2 (vermelho), o potencial zeta e a carga são altos (6,5), sugerindo alta estabilidade eletrostática.
Assim, ELS permite a avaliação das diferenças na estabilidade de dispersão devido às interações da superfície molecular em diferentes condições de formulação.
Tm e Avaliação da Estabilidade Térmica (Tagg) Usando o DLS (DLS)
Comparação da Estabilidade Térmica da Recombemina sob 10 Diferentes Condições de Formulação
No desenvolvimento do ingrediente farmacêutico ativo (API), é crucial projetar uma formulação que ofereça uma estabilidade apropriada sob condições recomendadas de manuseio e em armazenamentos prolongados.
Usando DLS, é possível obter a temperatura em que começa a agregação (Tagg) a partir da mudança no tamanho das partículas sob aquecimento, permitindo a avaliação da estabilidade térmica em várias condições de solvente. As condições de alta estabilidade térmica são consideradas estáveis também em armazenamentos prolongados. A imagem abaixo apresenta os resultados de medição em aquecimento pela DLS de recombina em diferentes tampões ajustados a vários pH. A maioria das amostras ajustadas entre pH 3-10 apresentaram semelhante Tm (67-68 ºC). As duas amostras formuladas a pH 6 (vermelho) não iniciaram a agregação até Tm exceder 74 ºC, mostrando maior estabilidade térmica. Em contrapartida, as amostras formuladas a pH 3 (verde) e 4 (amarelo) mostraram-se em estado já desnaturado, como evidenciado pelo aumento do tamanho das partículas no início do aquecimento.
Assim, a medição em aquecimento pelo DLS permite a avaliação da estabilidade térmica sob diferentes condições de formulação.
Tm e Avaliação da Estabilidade Térmica Usando T1/2 (Calorimetria Diferencial de Varredura DSC)
Comparação da Estabilidade Térmica de Anticorpos sob 19 Diferentes Condições de Formulação
As condições de formulação de biofármacos (tipo de tampão, pH, aditivos) podem ser refinadas comparando a estabilidade térmica da amostra nas várias soluções usando calorimetria diferencial de varredura (DSC). Os dados no topo são de DSC comparando três soluções de diferentes pH para o mesmo anticorpo. A posição do pico principal em pH 3,5 é deslocada para temperaturas mais baixas e o início da desnaturação está mais baixo que pH 5,5 e 6,2, indicando condições de baixa estabilidade térmica. O gráfico do meio retrata a medição DSC de um anticorpo em 19 soluções com diferentes tampões e pH, comparando a temperatura de desnaturação do pico principal (Tm). Doze condições, entre Acetato 5,0 e Tris 7,5, mostraram Tm aproximadamente semelhante (seta vermelha do meio), sendo considerados candidatos para condições de formulação. Embora normalmente se refine condições de formulação por esse método, o gráfico inferior compara o anticorpo imediatamente após ajuste (azul) e após uma semana (amarelo) em temperatura média (T1/2). Metade da largura à meia altura do pico principal no gráfico inferior indicou condições ainda mais restritas (seta vermelha inferior).
Usando múltiplos parâmetros obtidos de DSC, é possível refinar as condições de formulação comparando a estabilidade térmica das amostras sob diferentes condições de tampão.
Quantificação de Agregados de Proteínas Usando Luz Espalhada (NTA )
Na pesquisa e desenvolvimento farmacêutico, detectar e quantificar SVPs (Partículas Subvisíveis) é crucial.
A Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA) usa laser direto em partículas presentes em solução e detecta a luz espalhada pela câmera, permitindo detectar partículas submícron e nano que não são visíveis em microscópios óticos, com tamanho inferior a 10 nm*. O rastreamento do movimento Browniano na solução através do processamento de imagens permite o cálculo do tamanho das partículas simultaneamente. Agregados de proteínas de 50 nm ou mais são detectáveis, permitindo preencher a lacuna entre análise por microscopia ou citometria de fluxo e cromatografia.
A imagem abaixo mostra proteínas em tampão em que agregados foram detectados, se fortalecendo ao nível em que a luz espalhada pode ser detectada. O eixo x representa o tamanho, enquanto o eixo y representa a contagem de partículas.
Usando NTA, é possível visualizar agregados que dificilmente são detectáveis por métodos convencionais, apoiando assim a determinação de condições de formulação melhores. *Depende do material ou densidade das partículas.
Avaliação Quantitativa de SVP sob Diferentes Condições de Formulação Usando Luz Espalhada (NTA)
Detecção de SVP em Insulina com Quatro Diferentes Antioxidantes
Com NTA, pela área de medição ser conhecida, é possível calcular a concentração de partículas de SVP. O gráfico abaixo mostra os resultados da análise de SVP em insulina 1 mg/mL com 100 µM de diferentes antioxidantes adicionados, armazenada a 4 °C por 72 horas. O eixo x representa o tamanho, enquanto o eixo y representa a contagem de partículas. A insulina em PBS sem antioxidantes (A) mostra baixa concentração de SVP detectáveis. Distinções foram observadas entre quais antioxidantes geram mais partículas agregadas (B, D, E) e quais não (C).
Assim, NTA permite avaliação quantitativa do conteúdo de SVP sob diferentes condições de formulação, apoiando a determinação de condições de formulação melhores.
Avaliação da Estabilidade Térmica com Mudanças na Distribuição do Tamanho das Partículas (DLS)
Comparação das Alterações de Tamanho em um Teste Acelerado com ConA em Presença de Quatro Diferentes Açúcares
O DLS permite a avaliação da estabilidade térmica quando aditivos são adicionados à formulação de proteínas.
O gráfico abaixo apresenta as medições elevadas de concentração de temperatura de Concanavalina A (Con A) 1 mg/mL com diferentes açúcares (10 mM) feitos através de DLS, mostrando como a estabilidade térmica é afetada pela ligação aos açúcares. O eixo x representa o tamanho, enquanto o eixo y representa a distribuição da intensidade da luz (Intensidade (%)). No estágio inicial a 35 ºC, o estado é uniforme e as posições dos picos são sobrepostas. No entanto, a 47 ºC, a condição inferior revela diferenças no estado dos agregados (tamanho, quantidade) pelas diferentes espécies de açúcares.
A partir do estado ao redor de 10 nm, observa-se que a ausência de açúcar (violeta claro) e a presença de Galactose (verde) resultam no aumento do tamanho das partículas e agregação, enquanto Glucose (azul), Frutose (preto) e Manose (vermelho) melhoram a estabilidade térmica ao se ligarem ao Con A.
O uso do DLS permite avaliar o impacto da estabilidade térmica devido a aditivos diferentes através de mudanças de tamanho, apoiando a determinação de condições de formulação apropriadas.
Avaliação da Estabilidade com Mudanças de Tamanho (SEC-LS)
Confirmação de Associação, Agregação e Fragmentação pelo Teste Acelerado de Anticorpos
A cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) é comumente usada na avaliação da estabilidade de formulações proteicas por teste acelerado.
A imagem abaixo ilustra os resultados da medição do anticorpo IgG em amostras setadas em vial e aquecidas em banho-maria antes de ser medida por SEC. Comparando os resultados imediatamente após a configuração (vermelho) e após ser mantido a 60 ºC por 135 minutos (roxo) mostram maior proporção de monômero e menor proporção de dímero na última. Após 60 horas a 60 ºC, o agrupamento acelerou-se e grandes agregados (seta vermelha: em torno de RV 6 mL) foram detectados, e uma nova crista no fim do pico de monômero (seta amarela: em torno de RV 10 mL) revelou fragmentação.
SEC permite avaliação da agregação e fragmentação do anticorpo pela variação em estabilidade da amostra no teste acelerado, apoiando a determinação de melhores condições de formulação.
| Massa molecular (Da) (Conteúdo (%)) | ||||
| Agregado | Dímero | Monômero | Desconhecido | |
| No início | 654,500 (4.5) | 294,500 (14.3) | 147,100 (81.2) | – |
| 60 ºC / 135 min | 547,100 (1.8) | 293,500 (5.2) | 145,900 (93.0) | – |
| 60 ºC / 60 h | 3,081,000 (1.2) | 588,400 (9.6) | 156,800 (75.0) | 133,400 (17.2) |
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