Técnicas de Avaliação de Propriedades na Desenvolvimento de Produtos Biofarmacêuticos: Controle de Qualidade

Estamos apresentando os itens a serem avaliados em cada estágio do desenvolvimento de produtos biofarmacêuticos, bem como as técnicas de medição da Malvern Panalytical que permitem essa avaliação. Nesta página, apresentamos detalhes sobre “Controle de Qualidade”.

Avaliação de Tamanho Multidirecional Usando Múltiplos Detectores (SEC-LS · Vis)

Avaliação de Peso Molecular Absoluto e Viscosidade Intrínseca de β-Amilase

Combinando a Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC) com um detector de espalhamento de luz (LS), é possível determinar o peso molecular absoluto. Este peso molecular absoluto correlaciona-se com o peso da molécula, sendo que quanto maior for a molécula, maior será a difração da luz, e quanto menor for a molécula, menor será a difração. O gráfico abaixo mostra os resultados da medição da SEC-LS da β-Amilase. Com o peso molecular obtido da curva de calibração, os dois picos podem ser considerados como o agregado no início e como um monômero no final. No entanto, ao analisar o peso molecular absoluto com o detector de dispersão de luz, é sugerido que os pesos moleculares dos dois picos são quase iguais, enquanto os valores de viscosidade intrínseca são diferentes, o que indica diferenças na estrutura molecular. Diferenças estruturais implicam volume molecular diferente, justificando a obtenção de dois picos.

Desta forma, avaliando múltiplos parâmetros com SEC, é possível realizar uma comparação de tamanho detalhada e precisa de proteínas formuladas.

	Pico 1	Pico 2
Eluição (mL)	14.60	15.97
Molécula (g/mol)	209,200	214,200
Viscosidade (dL/g)	0.1572	0.05705

T_m e T_1/2 como Indicadores de Previsão de Instabilidade (DSC)

Efeito da Oxidação Forçada na Estabilidade Térmica de Anticorpos

A calorimetria diferencial de varredura (DSC) permite comparar e analisar o efeito de oxidação, que pode ocorrer durante o armazenamento ou transporte após a formulação, utilizando a estabilidade térmica como indicador. O gráfico abaixo mostra medições de DSC realizadas antes e depois da oxidação forçada em anticorpos. Na amostra oxidada, observa-se que o início de desnaturação da T_m1 (T_onset) é menor e o pico está mais alargado comparado à amostra não oxidada. Por outro lado, o pico principal da T_m2 não mostrou mudanças significativas. Tais resultados sugerem que o domínio Fc-CH2 do anticorpo foi desestabilizado pela oxidação.

Desta forma, o uso de DSC permite avaliar quais domínios de um anticorpo farmacêutico são afetados pela oxidação.

Confirmação de Atividade de Ligação por Indicadores de Alteração de Entalpia (DSC)

Correlação entre Estabilidade Térmica do gp120 e a Atividade de Ligação com CD4

Os dados obtidos através de DSC indicam que, se a estrutura terciária da amostra for mantida, os picos são idênticos em concentração e condições de buffer semelhantes. A figura abaixo (a) mostra dados DSC de diferentes lotes da proteína gp120. Embora o topo do pico esteja em 61 ºC em ambas as situações, observam-se diferenças de tamanho entre os picos. A parte (b) plota as alterações de entalpia obtidas em (a) no eixo x em relação à atividade de ligação com CD4 no eixo y (%). A correlação linear entre alteração de entalpia e atividade de ligação sugere que lotes com menor alteração de entalpia contêm moléculas inativas.

Assim, o uso de DSC viabiliza a avaliação da qualidade após a fabricação.

Avaliação de Equivalência Usando a Semelhança de Forma de Pico como Indicador (DSC)

Avaliação de Equivalência em Diferentes Lotes de Anticorpos

Os termogramas obtidos através de DSC mostram que, se a estrutura teritiária da amostra estiver mantida, é possível obter a mesma forma (impressão digital) sob as mesmas condições de solvente e concentração. Se as formas obtidas forem diferentes, é sinal de que a estrutura da amostra contém componentes parcialmente instáveis. Além disso, se a forma for similar mas a área do pico for reduzida, sugere-se a inclusão de amostras que já sofreram desnaturação em solução.

O gráfico abaixo avalia a equivalência entre lotes de anticorpos após a formulação. Como as formas dos termogramas são consistentes entre si, é sugerido que a equivalência é mantida entre os lotes.

Assim, o uso de DSC permite avaliar a equivalência das formulações proteicas entre lotes e locais.

Avaliação de Equivalência Usando Afinidade e Razão de Ligação como Indicadores (ITC)

Avaliação da Atividade de Ligação de Proteínas de Diferentes Lotes

A razão de ligação (n) obtida através da calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é representada graficamente pelo valor na linha de “concentração de amostra da seringa/concentração de amostra da célula” no eixo horizontal. É comum posicionar a proteína na célula e avaliar sua atividade de ligação comparando a razão de ligação. A figura abaixo demonstra a comparação da atividade de ligação ITC entre lotes diferentes de uma proteína. Um peptídeo conhecido foi usado na seringa. Enquanto a inclinação da curva sigmóide obtida foi praticamente idêntica, a afinidade mostrou uma pequena diferença entre o lote 1 (97,1 nM) e lote 2 (135 nM). Contudo, a razão de ligação foi diferenciada: 1,05 locais no lote 1 contra 0,235 locais no lote 2. A manutenção da atividade de ligação teórica torna a razão de ligação 1 (100%). Logo, 24% da atividade de ligação foi mantida no lote 2.

Assim, através do uso de ITC, é viável avaliar se a atividade de ligação de uma formulação proteica é mantida entre lotes e locais.

Avaliação de Tamanho e Distribuição do Diâmetro de Partículas Usando o Diâmetro e PdI Como Referência (DLS)

Comparação da Estabilidade Coloidal de Anticorpos Sob Condições Diferentes de Armazenamento

As condições de armazenamento de anticorpos têm um impacto crucial na qualidade do produto. A avaliação das condições ideais de armazenamento é possível através da medição do diâmetro de partículas usando a técnica de espalhamento de luz dinâmico (DLS).

O gráfico abaixo exibe os resultados da medição do tamanho das partículas de IgG em diferentes condições de armazenamento. Na condição de 4 ºC por 35 dias (verde), não ocorre agregação e o índice de polidispersidade (PdI) é baixo. Em contrapartida, as condições de armazenamento após 5 ciclos de congelamento/descongelamento (vermelho) mostram agregado de partículas grandes e PdI elevado. A amostra armazenada a 25 ºC por 31 dias (azul) apresenta pouca agregação, porém um leve aumento no PdI, sugerindo que a avaliação de PdI, além do tamanho das partículas, serve como indicador mais detalhado da influência das condições de armazenamento.

Assim, a avaliação do tamanho e distribuição de partículas de proteínas formuladas sob diferentes condições ao longo do tempo é essencial para otimização das condições de armazenamento.

Avaliação Temporal de SVP por Espalhamento de Luz (NTA)

Observação Temporal de SVP em Anticorpos Expostos a Condições Severas

A avaliação de qualidade geralmente requer testes acelerados. Além do diâmetro das partículas, considerar a concentração das partículas via análise de nanopartícula (NTA) permite uma avaliação mais detalhada. O gráfico abaixo mostra resultados de análise NTA de IgG submetido a condições severas além do teste acelerado padrão. A análise da formação de SVP realizado em IgG ajustado a 1 mg/mL e aquecido a 50 ºC revela um aumento na concentração de SVP ao longo do tempo, acompanhado de maior formação de agregados grandes.

O uso de NTA permite, assim, a avaliação quantitativa de SVP.

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