Análise de Agregação de Proteínas Terapêuticas 〜 Análise Quantitativa e de Características de Partículas Subvisíveis (SVP)

Na análise de agregação de proteínas terapêuticas, introduzimos as razões para a necessidade de análise quantitativa e de características de SVP (Sub Visible Particle), métodos de análise de SVP e resultados de análise provenientes da Malvern Panalytical, bem como casos de análise e melhorias em características de partículas.

Índice

• Razões para a Necessidade de Análise Quantitativa de Agregados e de Características de Partículas
• Métodos de Análise de SVP para Análise Quantitativa de Agregados e Resultados de Análise da Malvern Panalytical

• Método de Análise SVP 1: DLS, LD que cobre uma ampla faixa
• Método de Análise SVP 2: SEC, AUC, que são excelentes para avaliação quantitativa de monômeros a oligômeros
• Método de Análise SVP 3: Método NTA, RMM que cobre a região submicrônica
• Análise de Características de Partículas para Análise Quantitativa de Agregados, e Estudo de Caso para Melhorias
  • Caso 1: Melhoria no Processo de Produção de Anticorpos Terapêuticos
  • Caso 2: Agregados de Proteínas e Gotas de Óleo de Silicone em Injetáveis
• Equipamento de Análise Relacionado da Malvern Panalytical

Razões para a Necessidade de Análise Quantitativa de Agregados e de Características de Partículas

A agregação em proteínas terapêuticas como medicamentos à base de anticorpos, não pode ser confirmada visualmente. Assim, é necessário realizar uma avaliação quantitativa do grau de agregação usando algum tipo de equipamento de análise.

Por outro lado, também é necessária a caracterização das partículas (Particle Characterization) para distinguir se as partículas detectadas são derivadas de proteínas, aditivos (como açúcares), ou outros resíduos.

Como muitas dessas partículas existem entre a área visível e a completamente invisível, elas também são chamadas de Sub visible particle, ou abreviadamente SVP. Abaixo são listadas várias análises de SVP e os resultados de análise realizados pela Malvern Panalytical.

Métodos de Análise de SVP para Análise Quantitativa de Agregados e Resultados de Análise da Malvern Panalytical

A FDA e diversas autoridades de cada país e região recomendam a avaliação do SVP usando múltiplos equipamentos. Isto porque, infelizmente, cada método tem suas vantagens e desvantagens e há um risco de erros na análise utilizando apenas um único método. A Malvern Panalytical possui uma ampla linha de equipamentos na área de análise de SVP, sugerindo assim o método mais adequado conforme a situação.

Além disso, em 2014, a FDA emitiu diretrizes sobre a “Avaliação da Imunogenicidade de Produtos Biológicos”, que incluem a medição de agregados de proteínas como um dos itens.

Método de Análise SVP 1: DLS, LD que cobre uma ampla faixa

DLS (Dynamic Light Scattering) e LD (Laser Diffraction/Scattering) não são qualitativos, mas, devido à sua vasta faixa dinâmica, são métodos adequados para indicar a distribuição geral das proteínas.

O gráfico a seguir mostra a distribuição de tamanho de partículas de um anticorpo terapêutico comercializado (vermelho) e de um IgG de pesquisa (verde) por DLS. O anticorpo terapêutico mostrou uma distribuição mais estreita, indicando que ele é produzido de forma mais uniforme em termos de tamanho (forma).

Método de Análise SVP 2: SEC, AUC, que são excelentes para avaliação quantitativa de monômeros a oligômeros

Atualmente, não existe um princípio que cubra todas as faixas para a realização de avaliações quantitativas. Os princípios que podem começar a partir de monômeros (aproximadamente 10 nm, no caso de anticorpos de comprimento total) incluem SEC (Size Exclusion Chromatography) e AUC (Ultracentrifugação Analítica).

Entre eles, o SEC é conveniente para calcular a proporção de monômeros/oligômeros. Além disso, com um detector de espalhamento de luz, é possível determinar diferenças detalhadas de massa molecular.

Método de Análise SVP 3: Método NTA, RMM que cobre a região submicrônica

Na região submicrônica (0.1 – 1 μm) onde a presença é particularmente grande entre os SVPs, apenas recentemente a detecção quantitativa se tornou possível, incluindo métodos como NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) e RMM (Resonant Mass Measurement).

A região submicrônica não só é fácil de ser avaliada quantitativamente devido à sua alta presença, mas nos últimos anos também tem mostrado uma relação proeminente com a imunogenicidade, levando a FDA a fortemente recomendar sua medição.
O gráfico mostra resultados medidos pelo Archimedes (RMM), demonstrando uma diferença clara na quantidade de SVP entre uma formulação estável e uma instável.

Análise de Características de Partículas para Análise Quantitativa de Agregados, e Estudo de Caso para Melhorias

A FDA também recomenda a análise de caracterização de partículas. Além disso, recomenda-se “at least 2 orthogonal analytical techniques (análise por pelo menos 2 princípios)”.
Os princípios de Particle Characterization começam com o “existem partículas”. Dependendo se as partículas detectadas são identificadas como algo diferente, as estratégias de aprimoramento podem variar. Por exemplo, se as partículas forem derivadas de proteínas, então a proteína ou a formulação devem ser reconsideradas, mas se forem fragmentos de celulose, então materiais filtrantes ou colunas cromatográficas devem ser revisados. Neste caso, um método de imagem com uma função de Raman pode permitir caracterização de partículas, mesmo quando a forma é difícil de discernir.

Caso 1: Melhoria no Processo de Produção de Anticorpos Terapêuticos

Caso 2: Agregados de Proteínas e Gotas de Óleo de Silicone em Injetáveis

O caso mais comum onde materiais diferentes das proteínas são detectados como partículas é nos produtos farmacêuticos pré-cheios, que têm aumentado significativamente nos últimos anos. Formulações pré-cheias são vendidas com soluções protéicas já contidas na seringa, mas muitas vezes óleos (como óleo de silicone) são aplicados internamente para facilitar o deslizar do êmbolo. Mesmo que o óleo de silicone em si não seja um problema, recentemente foi relatado que ele pode promover a agregação de proteínas, destacando a necessidade de verificar suas quantidades.

Equipamento de Análise Relacionado da Malvern Panalytical

	Equipamento de Medição de Tamanho de Partículas, Potencial Zeta e Peso Molecular – Série Zetasizer Contribuindo para a pesquisa, desenvolvimento e controle de qualidade em nanotecnologia, a série Zetasizer permite medir tamanho de partículas, potencial zeta e peso molecular absoluto. Com funcionalidades complexas relacionadas a medições de partículas, é um equipamento rico em funcionalidades, mas de operação simples.
	Equipamento de Medição de Tamanho de Partículas por Rastreamento de Nanopartículas – Série NanoSight Ao rastrear o movimento browniano das partículas, medidas de distribuição de tamanho de partículas e concentração de partículas são obtidas com alta resolução.
	Sistema GPC/SEC com Múltiplas Detecções de Alta Sensibilidade, Alta Precisão e Alta Performance – OmniSEC Com um sistema GPC/SEC de detecção múltipla de máxima sensibilidade, amostras diluídas ou de baixo peso molecular podem ser medidas com alta precisão e alta reprodutibilidade.
	Analisador de Imagem de Partículas e Espectroscopia Raman – Morphologi 4-ID Equipamento de análise aplicável a produtos farmacêuticos, cerâmicas, baterias e produtos químicos. Mede automaticamente o tamanho e a forma das partículas, permitindo medições significativamente diferenciadas.

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