O Caminho para se Tornar um Mestre em Calorímetro Vol.10 Episódio Final: Tudo sobre Calorímetros – Diálogo Profissional

por Malvern Panalytical, Thursday, 17th November 2016

Desta vez, convidamos o Professor Fukada da Universidade de Osaka e o Professor Lee do Instituto de Pesquisa de Proteínas da Universidade de Osaka para falarem sobre calorímetros. Eles discutiram como começaram a usar calorímetros, suas pesquisas atuais e responderam a perguntas frequentes dos usuários.
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1. O que te motivou a começar a fazer medições de calor?

Minha experiência com calorimetria tem cerca de 13 anos, tendo começado com ITC de forma autodidata. O ímpeto foi uma pesquisa usando ressonância magnética nuclear (NMR) em solução. Estava investigando a ligação entre uma enzima e seu parceiro usando NMR em solução, quando detectei um aumento na flutuação da enzima até o nível dos resíduos de aminoácidos quando se uniram. Geralmente, quando ocorre a ligação, a estrutura proteica se torna mais rígida, e parte dos locais de ligação realmente se endurece, mas novas flutuações foram observadas em outros locais. Assim, considerando a equação ΔG = ΔH – TΔS, pensei que a ligação suavizaria a proteína e aumentaria a desordem do sistema. S, a entropia, reflete a desordem do sistema. Portanto, pensei que aumentar ΔS, a entropia conformacional neste caso, e baixar ΔG tornaria a reação de ligação mais favorável. ΔH é a mudança de entalpia e T é a temperatura. Coincidentemente, começaram a surgir artigos, principalmente dos EUA e da Europa, publicando sobre o aumento das flutuações das proteínas devido à ligação. Quando propus isso com confiança, não foi reconhecido por outros professores na época, que disseram que isso não ocorreria. Investiguei mais para provar esses resultados e me concentrei no fato de que ΔS poderia ser determinado por ITC. Felizmente, havia um MicroCal VP-ITC no laboratório da época e comecei a medir seguindo o manual. Realizei medições de ITC em diferentes temperaturas para obter ΔH a cada temperatura. A dependência de temperatura de ΔH fornece ΔCP, a mudança da capacidade calorífica sob pressão constante. Usando uma relação simplificada com a entropia da água, determinei ΔS de desidratação. Calculando a partir de um simples modelo das mudanças de ΔS totais do sistema fornecidas pelo ITC e a ΔS de desidratação, é possível deduzir as mudanças na entropia conformacional. Assim, comparamos os resultados de NMR e ITC, e provamos que a entropia conformacional aumentou devido à ligação, estabilizando o complexo. Sempre gostei da química física desde os tempos de graduação, especialmente entropia que expressa os fluxos naturais.
Eu conduzia medições de calorimetria desde a minha tese de graduação. Meu orientador foi o pioneiro em calorimetria bioquímica no Japão, o professor Takahashi Katsutada. Naturalmente, comecei com calorimetria e continuo nela até hoje. O Dr. Lee comentou que, mesmo depois de publicar sobre flutuações resultantes de ligações, não foi reconhecido. Cerca de 40 anos atrás, havia químicos argumentando que a entropia não poderia aumentar com a ligação. Claro, se a entropia conformacional ou o efeito de hidratação não estavam envolvidos, a entropia iria diminuir.
Por volta daquela época, surgiram discussões sobre desidratação aquosa e dobramento de proteínas, incluindo mudanças de entropia devido à desidratação. O estudo do Professor Fukada sobre mudanças de entalpia na desprotonação de tampões foi impressionante. (Referência 1)
Sou formado em Agronomia, e quando conduzia esses estudos, era criticado por não se tratar de pesquisa agrícola. Mas o Professor Takahashi encorajou esses estudos inovadores, valorizados na base das ciências biofísico-químicas, não poderiam ter sido realizados sem seu apoio.
Acredito que devemos investigar mais esses estudos fundamentais.
Sei que não é basilar, no verdadeiro sentido, mas em termos práticos, fornece dados básicos que pesquisadores químicos não utilizarão de imediato. É mais um conjunto de dados fundamentais de usos práticos.

2. Conte-nos sobre suas pesquisas recentes.

　

Recentemente, estou interessado na agregação de proteínas relacionadas a doenças. Doenças associadas à má-dobra e agregação de proteínas são chamadas de doenças de má-dobra proteica. A alta propensão de agregação quando as proteínas sofrem dobras incorretas pode causar doenças, como Alzheimer, Parkinson, diabetes tipo II, prionopatias, entre outras. Inicialmente, as revisões literárias referiam-se a mais de 20 doenças relacionadas à má-dobra e agregação, mas agora o número já ultrapassa as 40. Embora algumas doenças tenham poucos pacientes, novas doenças relacionadas à agregação continuam sendo descobertas. Agregação é algo que não pode ser ignorado.
Recentemente, estou focando na pesquisa sobre insulina também. A insulina é estável mesmo em pH baixo, assumindo uma estrutura semelhante à nativa. Quando o pH aumenta, a insulina se complexa, de monômero a dímero, hexâmero e assim por diante, mas, em pH 2 sem íons metálicos, ela permanece como monômero. Ao aumentar lentamente a temperatura em uma DSC, a insulina desnatura térmicamente, mostrando uma estrutura elongada e uma reação endotérmica (pico para cima) na DSC. Ao aumentar mais a temperatura, observa-se uma reação exotérmica intensa (pico para baixo) na DSC e, depois, o pico volta aos níveis de linha de base.
Após o experimento, a amostra retirada da célula está convertida em belas fibras amiloides. Essa replicação consistente também foi relatada por outro grupo. Entretanto, estou investigando condições de solvente diferentes. Curiosamente, por algum motivo, insulina ainda pode ser medida na DSC mesmo quando agregada. Tentei medir outras reações de formação de agregados, mas a reprodutibilidade se mostrou baixa. Ao introduzir fibras ou agregados amiloides preexistentes na DSC, a linha de base da DSC (linha Cp) caía bruscamente, e surgiam dados não reprodutíveis. A razão para a queda na linha de base ainda é desconhecida e é uma questão a resolver. Quando a temperatura sobe, as interações hidrofóbicas se intensificam, os agregados formados de proteínas desnaturadas são estáveis mas tendem a precipitar e aderir nas células DSC, tornando difícil o uso da DSC. Porém, isso ainda não é consenso geral. Com o uso do VP-Capillary DSC, a formação de agregados é suprimida em certo grau, sendo assim uma boa ferramenta para estudo da estabilidade térmica de proteínas globulares.
Portanto, passei a usar ITC para estudar a agregação proteica. Quando agitada dentro da célula, os agregados não se precipitam e, em certo modo, reações de grande porte como as de ribonucleoproteínas não ocorrem. Assim, é possível realizar medições ITC com boa reprodutibilidade.
Um bem-sucedido exemplo é a formação de fibras amiloides de β2-microglobulina, causadora de amiloidose de diálise (Referência 2, Ikenoue e Lee et al., PNAS, 2014). Quanto à insulina, também estou estudando as reações de agregação usando ITC. Estou planejando investigar, termodinamicamente, todas as mudanças estruturais que a insulina pode adotar, desde o processo de dobramento até a formação de fibras amiloides, usando combinações de ITC e DSC. Acredito que assim será possível descrever um mapa energético termodinâmico detalhado que retrate as mudanças estruturais e interações moleculares da insulina.
Isso é incrível. Insulina foi uma amostra de muita nostalgia para mim, remonta à época em que comecei a trabalhar com proteínas na pós-graduação. Naqueles tempos, removíamos zinco da insulina comprada, a alcalinizávamos para mantê-la como monômero e medíamos o calor envolvido na redução das pontes dissulfeto da insulina. Como não havia calorímetros modernos, usávamos garrafas de Dewar e medíamos o calor de reação com termômetros de termistor em condições de temperatura constante. Requeríamos cerca de 20 mL de amostra.
Era necessária uma grande quantidade de amostra mesmo. Ainda há pedidos para medir amostras valiosas, onde não há sistema expressor e a proteína ou peptídeo deve ser comprado. A mesa amostra para um teste pode realmente custar muito, então reduzir a quantidade de amostra seria ideal.

3. Desenvolvimento do ITC na perspectiva do usuário

Eu realizei medições principalmente com o VP-ITC. Por vezes, devido à quantidade limitada de amostra, utilizei o iTC200 emprestado pelo Professor Shirakawa da Universidade de Kyoto e constatei que necessitava de menos amostra, equilibrava a temperatura rapidamente e oferecia um tempo reduzido de medição, vantagens consideráveis. Atualmente, estou utilizando o PEAQ-ITC, lançado após o iTC200. Os sistemas MicroCal ITC, apesar de cada um ter seus prós e contras, são atraentes por exigir pouca amostra. Quando o calor resultante é pequeno, as tentativas de ajuste podem ser insuficientes, exigindo uma nova medição com maior concentração. Mas comparado ao VP-ITC, há uma economia grande em amostra, e a rapidez na estabilização térmica surpreende. É possível realizar mais de 10 medições por dia, o que foi muito inovador para mim. Medindo a titulação com 1M NaCl para estudar agregação, as calorias eram altas e os volumes das titulações volumosas demais para o VP-ITC, atingindo a resposta máxima. Com o PEAQ-ITC usando menores quantidades, todos os valores podiam ser quantificados corretamente, surpreendendo-me favoravelmente. A menor quantidade de amostra significa reações mais rápidas, e a menor duração da medição evitou reações de agregação mais longas, reduzindo agregação. Com menores volumes é adaptativo, pois eventos de agregação ocorrem com menor frequência.
As medições de formação de fibra amiloide com o PEAQ-ITC revelaram claramente o calor desse processo. Os tempos de latência para a formação de fibras amiloides eram diferentes dos obtidos com o VP-ITC. Mesmo o tipo de ITC usado pode contribuir para a formação de fibras, devido a fatores como agitação, volume de células e microcurvatura interna das células. Cada vez mais, entendo que reações de formação de agregados são muito sensíveis.
A limpeza do PEAQ-ITC é automática para células e seringas, o que é excelente. No VP-ITC, se a limpeza não for completa, a reprodutibilidade das medições de agregação fica comprometida. Caso resíduos persistam, eles podem afetar os dados. A limpeza com surfactantes e aquecimento rápido por cerca de uma hora é fundamental no VP-ITC, seguida de acessórios de limpeza adicionais. Mas no PEAQ-ITC, apenas clicamos em funções de limpeza automática para obter resultados superiores. Recomendo usar a função Soak, especialmente após medições que envolvem formação de agregados, não apenas a lavagem. Quando houve erros por mau funcionamento, o PEAQ-ITC é bastante sensível e detecta condições inadequadas do fluxo de líquidos ou baixa pressão da bomba, prevenindo uma limpeza insuficiente.
 

4. Desenvolvimento do DSC na perspectiva do usuário

　

Comparado ao ITC, o desenvolvimento do DSC é menos avançado. No entanto, houve melhorias consideráveis na concentração de amostras para medições DSC. Agora, usando o VP-DSC, é possível medir em concentrações de 0,1 mg/mL, enquanto artigos da década de 90 ainda mencionam 10 mg/mL. A sensibilidade acurada do VP-DSC permitiu essa redução significativa.
Para biopreparações desde aquela época, 1 mg/mL era comum. 10 mg/mL referia-se ao DSC convencional. No DSC convencional, sólidos são medidos dentro de poços em cápsulas ou bandejas, diferindo do calorímetro micro que mede soluções diluídas. Professor Privalov (Universidade Johns Hopkins) desenvolveu o calorímetro Daresbury para medir soluções diluídas nos anos 60, então artigos com o calorímetro Daresbury de Privalov começaram a surgir nos anos 70. O sistema MicroCal DSC foi criado em 1977, e o VP-DSC veio em 1996 com células tipo moeda. O VP-Capillary DSC, com células do tipo capilar, surgiu apenas no século 21.
Usávamos MC-2 emprestado, com volume de célula de 1 mL e acima. Até o final do século, quase ninguém realizava calorimetria, então a quantidade exigida era grande. Com o VP-DSC, o mercado expandiu, com concentrações exigidas ainda mais baixas. Nos anos antigos, usavam-se calorímetros caseiros. Após o progresso nos produtos consagrados do mercado, a calorimetria ficou mais acessível. No passado, a calorimetria era mais reconhecida nos EUA; no Japão, a popularidade só decolou nos anos 1990 com o advento do VP-DSC.

5. A Calorimetria ainda é um campo desafiador? Quais são os valores de ΔCp?

　　 　　 　　 　　

Apesar do aumento do uso de calorímetros comerciais bem desenvolvidos, ainda vejo interesse na calorimetria ser elevado, mas tenho dúvidas se muitos optam por se aventurar nela, pode-se dizer que detalhes sobre medidas de biopolímeros seriam bem-vindos.
Há cerca de 15 anos, existia um manual sobre estabilidade estrutural de proteínas em inglês (referência 3). Contudo, nós não vimos esses dados coletados nos últimos 15 anos. Acredito que, em sintonia com recentes tendências, a quantidade de artigos publicados sobre estabilidade térmica de proteínas usando DSC diminuiu. Muitos que estudaram estabilidade e dobramento de proteínas globulares moveram seus estudos para desdobramento e agregação proteica e outras áreas aplicadas.
Falando sobre DSC, há muitos interessados em determinar Tm (temperatura de fusão), o ponto em que proteínas nativas e desnaturadas coexistem em equilíbrio. Pesquisadores de estrutura utilizam DSC não apenas para construção identificadas, mas também para avaliar estabilidade térmica. Criar proteínas termicamente estáveis é significativo em aplicativos industriais. Medição de estabilidade térmica não é apenas sobre Tm, fenótipo da estrutura e ácidos. A decisão é avaliar a termodinâmica e aplicá-la. Claro, há interesse no ITC também, mesmo que a necessidade de amostra deste seja maior que a do DSC. Caso a diferença seja delimitada, Tm e KD podem bastar. Ensinar a respeito da termodinâmica de calorimetria também é relevante.
Por exemplo, ΔCp caracteriza proteínas. Cada proteína tem valores e propriedades únicos, tal qual um humano tem um caráter distintivo. Pessoas tentam compreender proteínas pelos valores de ΔCp. Uma proteína é constituída por cadeias de aminoácidos, que então se dobram assumindo estruturas globulares funcionais e integrando sua forma tridimensional. Entender dobramento de proteínas é entender como aminoácidos hidrofóbicos evitam água enquanto os hidrofílicos mantêm contato. Resíduos Hidrofóbicos dentro da estrutura aumentam ΔCp, algo semelhante a pessoas com alto teor de gordura terem uma ΔCp alta.
Entretanto, algumas proteínas, chamadas de proteínas entrópicas ou desordenadas nativas, assumem menos estruturas tridimensionais no estado nativo. Caracterizam-se por carregarem menos resíduos hidrofóbicos e mais hidrofílicos. Assim, proteínas desordenadas nativas têm ΔCp menor que proteínas globulares. O valor ΔCp da proteína nativa é incipiente, enquanto da desordenada é menor e menos pronunciado, uma pesquisa ainda pouco realizada. Eu fiz medições com a proteína sintase alfa que causa Parkinson, por exemplo, e realmente não há pico de desnaturação ao aquecer uma proteína nativamente desordenada; sua ΔCp é próxima a zero. A importância das proteínas desordenadas nativas é clara, abrangendo mais de 30% dos eucariotos, entender ΔCp possibilita caracterizar estruturas nativas. ΔCp‘s usados de forma a explicar em termos de propriedades possibilita classificar proteínas globulares e nativamente desordenadas.
Obter valores físicos é especialmente desafiador sem amostras de qualidade. A concentração precisa ser definida corretamente primeiro.
Se a linha de base da DSC é ótima, fazer medidas de base constante a base constante pode ajudar a fornecer Tm e ΔCp sem ajuste de dados. Contudo, fornecer ΔCp de apenas uma experimento SDS provavelmente não é confiável, preferindo-se uma série de medições para captar o comportamento em diferentes temperaturas. A comparação de valores de Tm e ΔH nestas medições fornecerá cálculos mais acurados para a determinação de ΔCp.
 
Mas mesmo assim não pode-se afirmar totalmente que aquele é o verdadeiro ΔCp.
Sim, há pressupostos a serem considerados. Alguns usuários talvez já compreendam bem a estabilidade térmica das proteínas através de uma perspectiva de biologia estrutural e termodinâmica, mas geralmente há incertezas sobre ΔCp. Para explicar essa técnica a todos, utilizamos a marca do biópsia, sem perceber que a configuração muda com a temperatura, definindo estados nativos e marcados. Privalov, por exemplo, estudou a dependência de temperatura da linha de base de ΔCp natural, focando em possíveis diferenças estruturais nativas. Suas observações oferecem ideias valiosas.

6. Explique os parâmetros obtidos em um calorímetro de maneira clara!

　 　　

Cp é a quantidade de calor necessária para aumentar a temperatura de uma amostra em 1°C sob pressão constante (ΔCp com ‘p’). Altos valores indicam que muito calor é necessário. Comparo ΔCp à resistência ao calor. Ao ensinar físico-química de proteínas, uso analogias humanas para descrever termodinâmica como energia livre de Gibbs G, entropia S e entalpia H. Enfatizo que abaixando G os objetivos se tornam favoráveis, S representa a liberdade de escolha ou energia de folga que alguém tem. Entalpia representa o quanto se é capaz de suportar. Afinidades ou situações de laços emocionais são comparações para ΔG. Em termos de ΔCp, compará-la a resistência de uma pessoa é útil: pessoas que facilmente se irritam (ΔCp baixo) se aquecem facilmente após provocar (adicionar calor), enquanto pessoas de alto ΔCp são mais lentas em aquecer (toleram calor mais tempo). Comparar o relacionamento acadêmico do Professor Fukada a ΔCp alto, eu diria.
Em casos elogiosos, é difícil distinguir. (risos)
 
Explaining physical chemistry and thermodynamics concepts often leads to discouragement due to complex terminology. I strive to engage students by gently introducing concepts, making them progressively clearer.
Quando falamos de ITC, a afinidade é clara nos resultados. Contudo, entender ΔH e ΔS e discutir os parâmetros a partir deles é desafiador. ΔH inclui informações de interações moleculares como pontes de hidrogênio. Já S reflete a liberdade do sistema ou seu desengajamento de restrições. Interações complexas resultam em ΔH negativo (transferindo calor – potencializando laços energéticos – liberando calor). Mãos se apertando representam esse tipo de interação atrativa, entendida como transferência de calor ou liberação. Por outro lado, interações hidrofóbicas mobilizam mais entropia (difusão livre) sem energia, resultando em ΔH positivo (absorção de calor). Se relatarmos hidrocarbonetos, o monitoramento dos efeitos das ligações covalentes em ácidos graxos ao longo da cadeia é similar a isso.

7. Elementos Essenciais para Obter Dados Confiáveis

　 　　

Se a pureza e concentração da amostra são precisas, os dados obtidos são confiáveis. Quando valores são publicados, é importante que não circulem desmedidamente, devemos divulgar valores consistentes. Estou bastante interessado nos valores numéricos propriamente ditos, por isso faço medições repetidas sempre que possível.
Concordo totalmente. Além de acompanhar a qualidade da amostra, verificar a reprodutibilidade também é significativo. Comparações com outros métodos de obtenção de dados são necessárias. O ITC detecta tanto interações fortes quanto fracas, mas a cristalografia geralmente detecta as fortes, logo compreender esses descompassos é essencial. O ITC pode detectar interações que passam despercebidas por análise cristalográfica. Alguns aditivos em PEG podem influenciar efeitos de crowding molecular. Nesse caso, considerar fazer ITC em presença desses aditivos é benéfico.
Manter a célula do calorímetro limpa é crucial, com lavagens regulares após a medição. Mesmo sem bombeamentos manuais, deixo o detergente agir por 5 minutos dentro da célula. Quando as medições não acontecem sob condições ideais, a linha de base da resposta tem mais ruído e não deve ser utilizada em experimentos.
Concordo plenamente. Também insisto, ao guiar os estudantes, para lavar célula e seringa rigorosamente. Registrar os valores do DP da linha de base e padrões de saída ao medir é importante. Quando surgirem dados incomuns, o equipamento pode ser revisado rapidamente. Equipamentos mal regulados geram dados não confiáveis.

8. Sugestões de Literatura Relevante para Interpretação de Dados

Ao falarmos de termodinâmica relacionada a DSC e ITC, nomes como Sturtevant (Universidade de Yale), Privalov, Cooper (Universidade de Glasgow), Freire (Universidade Johns Hopkins) e Ladbury (Universidade de Leeds) são referências importantes. O artigo intro perspicaz do Professor Sturtevant em 1977 (Referência 4) se tornou uma bíblia nesse segmento. As seções sobre entropia, calor específico são amplamente lidas até hoje, mesmo por iniciantes na calorimetria que desejam aprimorar-se.
Sem dúvida, ao discutir a interpretação de dados, é útil revisitar tais trabalhos notáveis.
Durante um seminário online organizado pela Malvern, compilamos uma lista de referências relevantes – sugiro consultá-las para mais entendimento.
 
 Nature Protocols tem dois importantes artigos sobre ITC. Eles explicam métodos de medição, análise e preparo de amostras, dignos de se consultar. O professor Ladbury liderou Biocalorimetria 2 em 2004, e novos volumes podem ser aguardados. Leituras amigáveis aos iniciantes que orientam na vinculação de termodinâmica estruturada a dados ITC são ideais (Referência 6). Dicas envolvendo entropia conformacional são discutidas. Textos de Malvern, como “O Caminho para Mestre do Calorímetro”, também podem ser consultados.

9. Que tipos de medições você gostaria de realizar futuramente?

Tenho muitos interesses que podem ser explorados através do ITC. Um deles é dobramento proteíco. Mudar condições de solvente para observar calor durante pH Jump em proteína é um deles. Tendo uma proteína alterada por ácido, titule uma solução alcalina até pH neutro na cela que, quando um floco está presente, pode reativar o dobramento. A ideia é observar diretamente, ao contrário dos DSC que apenas acompanham a desnaturação enquanto medem calor. Há sistemas de enzimas que, ao serem tituladas na célula, podem induzir dobramento já na célula com proteína desnaturada, permitindo capturar o calor dessa ação. Além disso, um projeto desafiador em andamento visa medir agregação proteica usando ITC e estabelecer sua termodinâmica.
Simultaneamente ao desenvolvimento do método, desenvolvemos um ensaio para inibição de agregações proteicas usando ITC. Irei abordar esses pontos em um webinar promovido pela Malvern futuramente.
Parece fascinante.
Recentemente obtive dados de E. coli na DSC.
Anos atrás, testei levedura. Aplicando choques térmicos surgiram picos intensos.
Impressionante, Professor Fukada! Encontrei referências descritas em trabalhos que mediram o impacto tóxico de péptidos em E. coli por DSC. Embora um pico tenha surgido, não foi tão ideal quanto nos artigos. Pretendo tentar novamente mais tarde.
Medir microorganismos apresenta desafios de reprodutibilidade. Os efeitos de etapas anteriores afetam a precisão.
Detalhes podem variar dependendo do crescimento. Aprendi muito sobre a complexidade da vida existente.
Compreendo. ITC pode ser usado também para reação enzimática em análise cinética de Michaelis-Menten. Planejo aplicar o método de troca molecular de kinoff recentemente relatado pelos espanhóis à análise ITC futura. O rápido progresso do ITC é encorajador.
Notas de Aplicação Relacionadas:
Determinando Constantes Cinéticas de Enzimas

Determinando Constantes de Velocidade

Espanhóis adoram análise cinética. No passado, houve interesse em modelagem cinética com DSC, chocando ao aplicar reversibilidade de meios equilibristas para desnaturações: algo que incitou críticas.
Embora diferendo as reações ITC, o DSC pode ser usado para análise cinética. Ao atravessar o modelo Lumry-Eyring, combinando com modelos de aglomeração reversíveis, atribuímos cinética. Isso está se expandindo, enquanto aplicamos modelos em outras reações para análises cinéticas.
Falando de constantes de velocidade, a que faixa estão distantes para ITC analisar?
No mínimo, em termos de tempo, a ordem dos segundos para analisar em ITC. Reações rápidas já são desafiadoras. Constantes de velocidade a partir de temperaturas servem para calcular energias de ativação, ajustando-se para construir perfis energéticos detalhados.
Complexos rápidos de ligação acontecem além do intervalo de segundos, mas comissões lentas permitem análise em ITC, provando uma importante técnica permitindo essas avaliações.
 

【Epílogo do Diálogo】

O episódio final da série “O Caminho para o Mestre Calorímetro” foi marcado pelo diálogo com o Dr. Fukada da Universidade de Osaka e Dr. Lee do Instituto de Pesquisa Proteica da Universidade de Osaka. Ao longo de 18 meses, procuramos tornar os calorímetros mais acessíveis em conteúdo básico. Até que ponto fomos felizes nisso? Discutimos interpretação de parâmetros de medição com os doutores Fukada e Lee, oferecendo visões práticas além dos livros didáticos. Pensamos que isso ajudou muitos a aprofundar seu entendimento.
Continuaremos oferecendo tecnologia e informações valiosas para suas pesquisas. A Malvern agradece sinceramente os esforços do Dr. Fukada e a colaboração do Dr. Lee na série e nos webinars.
Clique no botão “Download” abaixo para a lista de referências mencionadas no texto.

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