Como a concentração da amostra pode afetar a forma do pico nos dados do OMNISEC
Existem muitos fatores que podem afetar a qualidade dos seus dados de OMNISEC GPC/SEC. Isso inclui coisas como métodos de análise, fase móvel e conjunto de colunas, mas também podem incluir parâmetros menos óbvios, como concentração e volume de injeção.
Menciono concentração e volume de injeção juntos porque ambos influenciam a massa da amostra introduzida no sistema. Uma injeção de 100 µL de uma amostra de 2 mg/mL carrega a mesma quantidade de amostra que uma injeção de 50 µL de uma amostra de 4 mg/mL. Isso é importante lembrar se estiver tentando otimizar as condições de análise, pois é possível usar a mesma amostra preparada e simplesmente ajustar o volume de injeção, em vez de preparar várias amostras em concentrações variadas.
Qual é a concentração ideal para minha amostra?
Assim como muitas coisas com GPC/SEC, a resposta depende da sua amostra e do sistema. Um intervalo geral de concentração de amostra é de 3-5 mg/mL; é o que busco quando estou analisando amostras pela primeira vez. Se você tem um conjunto de colunas com muitas colunas (mais de três), pode ser necessário injetar mais amostra do que o esperado, já que cada coluna dilui a quantidade de amostra passando pelos detectores em qualquer momento. No entanto, se estiver analisando uma amostra que você sabe ter um peso molecular muito alto, provavelmente precisará usar uma concentração inferior ao intervalo sugerido de 1-5 mg/mL.
Você deseja injetar amostra suficiente para obter bons sinais de detecção, mas também garantir que não sobrecarregue o conjunto de colunas, o que pode resultar em cromatografia incomum. Para mim, uma concentração ideal de amostra é aquela que carrega a quantidade mínima necessária para obter respostas confiáveis em todos os detectores.
Como posso saber se estou sobrecarregando o conjunto de colunas?
Essa é uma ótima pergunta! A pista mais notável é a forma do pico da sua amostra.
Na imagem abaixo, incluí um cromatograma de multi-detector de uma amostra exibindo um pico com um ombro. Isso por si só não necessariamente é motivo de preocupação; essa forma pode representar, com precisão, a distribuição do peso molecular da amostra.
No entanto, se você esperava que sua amostra apresentasse uma distribuição mais Gaussiana, então pode suspeitar que algo não está certo. A primeira coisa que eu faria nessa situação é inspecionar a magnitude de cada pico, especialmente o sinal de índice de refração (RI) (que corresponde diretamente à concentração da amostra).
No exemplo acima, a altura do pico de RI é superior a 400 mV. Assim como a forma do pico, isso por si só não é necessariamente um problema. Mas indica que há espaço para a concentração da amostra (ou volume de injeção) ser reduzida sem se tornar indetectável. Isso vale para os outros detectores, também.
Portanto, para determinar se a amostra está sobrecarregando o conjunto de colunas, foi preparada uma série de diluições da amostra para analisar a amostra em concentrações mais baixas e monitorar quaisquer mudanças na forma do pico.
Série de diluição
Além da análise original, foram realizadas três análises em concentrações mais baixas. Os cromatogramas de RI dessas injeções estão sobrepostos abaixo.
Como esperado, a magnitude do pico da amostra diminui com cada diluição. E junto com a primeira diluição, há uma mudança na forma do pico – o ombro desaparece! Isso sugere que a concentração da primeira injeção era muito alta para o conjunto de colunas e, uma vez que foi reduzida, a amostra pôde ser separada adequadamente e a distribuição Gaussiana esperada foi observada.
Gráfico de Mark-Houwink
Para confirmar que a estrutura da amostra não estava mudando com a concentração, foi analisado o gráfico de Mark-Houwink de todas as quatro injeções, mostrado abaixo.
A maioria dos gráficos se sobrepõe bem, indicando uma estrutura consistente. A linearidade dos gráficos é como esperado para polímeros sintéticos, lineares, onde o peso molecular (comprimento da cadeia) e o tamanho molecular aumentam a taxas constantes, relativas entre si.
O gráfico da primeira injeção com o ombro, mostrado em vermelho, apresenta um cotovelo na região de menor peso molecular, muito provavelmente resultado da cromatografia comprometida.
Concentração ideal
Como disse anteriormente, acho que a concentração ideal é a concentração mínima necessária para obter respostas confiáveis em todos os detectores. O cromatograma de multi-detector da última injeção na série de diluição, mostrado abaixo, fornece sinais fortes para todos os detectores sem nenhum ombro. Essa concentração é cerca de um quarto da concentração original.
Considerações finais
Em conclusão, espero que este exame de concentração e seus efeitos sobre a forma do pico ajude você a se tornar um usuário mais proficiente do OMNISEC. Se você tiver alguma dúvida, não hesite em nos contatar ou me enviar um e-mail diretamente para kyle.williams@malvernpanalytical.com.
Conteúdo relacionado
Este artigo pode ter sido traduzido automaticamente
{{ product.product_name }}
{{ product.product_strapline }}
{{ product.product_lede }}
