Die zuverlässige Messung der Bindungskinetik von Analyten mit niedrigem Molekulargewicht an ihre Ziele ist nach wie vor eine anspruchsvolle Aufgabe. Oft ist die Einführung von Markern bei solchen Messungen schlichtweg unmöglich, und die Anwendung markerfreier Methoden ist die einzige zuverlässige Wahl.
Durch die Messung der Bindungskinetik von Ni(II)-Ionen an gentechnisch veränderte Flagellinschichten zeigen wir Folgendes: (1) Die Gitter-gekoppelte Interferometrie (GCI) ist gut geeignet, um die Bindung von Ionen auch bei sehr geringen Proteinimmobilisierungsgraden zu bestimmen. (2) Sie liefert qualitativ hochwertige kinetische Daten, aus denen die Anzahl und Stärke der verfügbaren Bindungsstellen ermittelt werden können. (3) Die Ratenkonstanten der Bindungsereignisse können ebenfalls mit hoher Genauigkeit ermittelt werden. Die Experimente wurden mit einer Flagellin-Variante durchgeführt, die die C-terminale Domäne des auf Nickel reagierenden Transkriptionsfaktors NikR enthält.
Die GCI-Ergebnisse wurden mit Affinitätsdaten aus der Titrationskalorimetrie verglichen. Wir haben festgestellt, dass neben den Bindungsstellen mit niedriger Affinität, die durch eine mikromolare Dissoziationskonstante (Kd) gekennzeichnet sind, tetramerische FliC-NikRC-Moleküle hochaffine Bindungsstellen mit Kd-Werten im nanomolaren Bereich besitzen. Mit GCI konnten wir kinetische Echtzeitdaten für die spezifische Bindung von Analyten mit einer molaren Masse von bis zu 59 Da gewinnen, selbst bei Signalen unter 1 pg/mm2.
Die zuverlässige Messung der Bindungskinetik von Analyten mit niedrigem Molekulargewicht an ihre Ziele ist nach wie vor eine anspruchsvolle Aufgabe. Oft ist die Einführung von Markern bei solchen Messungen schlichtweg unmöglich, und die Anwendung markerfreier Methoden ist die einzige zuverlässige Wahl.
Durch die Messung der Bindungskinetik von Ni(II)-Ionen an gentechnisch veränderte Flagellinschichten zeigen wir Folgendes: (1) Die Gitter-gekoppelte Interferometrie (GCI) ist gut geeignet, um die Bindung von Ionen auch bei sehr geringen Proteinimmobilisierungsgraden zu bestimmen. (2) Sie liefert qualitativ hochwertige kinetische Daten, aus denen die Anzahl und Stärke der verfügbaren Bindungsstellen ermittelt werden können. (3) Die Ratenkonstanten der Bindungsereignisse können ebenfalls mit hoher Genauigkeit ermittelt werden. Die Experimente wurden mit einer Flagellin-Variante durchgeführt, die die C-terminale Domäne des auf Nickel reagierenden Transkriptionsfaktors NikR enthält.
Die GCI-Ergebnisse wurden mit Affinitätsdaten aus der Titrationskalorimetrie verglichen. Wir haben festgestellt, dass neben den Bindungsstellen mit niedriger Affinität, die durch eine mikromolare Dissoziationskonstante (Kd) gekennzeichnet sind, tetramerische FliC-NikRC-Moleküle hochaffine Bindungsstellen mit Kd-Werten im nanomolaren Bereich besitzen. Mit GCI konnten wir kinetische Echtzeitdaten für die spezifische Bindung von Analyten mit einer molaren Masse von bis zu 59 Da gewinnen, selbst bei Signalen unter 1 pg/mm2.
