Ein grundlegendes Einführung in die Dynamic Light Scattering (DLS) zur Partikelgrößenanalyse – Q&A

Der Interzept-Wert ist das Signal-Hintergrund-Verhältnis und der Wert variiert je nach Probengröße und optischer Instrumentenkonfiguration. Geeignete Werte liegen zwischen 10 % und 100 % (d. h. 0,1 bis 1,0). Ein niedriger als erwarteter Wert kann auf eine zu hohe oder zu niedrige Probenkonzentration, Absorption oder Fluoreszenz der Probe hinweisen. Eine zu hohe Probenkonzentration kann zu Mehrfachstreueffekten führen, die den Interzeptwert reduzieren. Die NIBS-Konfiguration des Zetasizer Nano S/ZS/ZSP erlaubt es, die Weglänge des Laserstrahls zu minimieren, wodurch wiederum jede vorhandene Mehrfachstreuung minimiert wird. Wenn es eine geringe exzessive Streuung gibt, d. h. den Unterschied in der Streuung zwischen dem Dispergiermittel und den dispergierten Partikeln im Dispergiermittel, dann wird der Interzept niedrig sein. Das Vorhandensein von Probenfluoreszenz oder -absorption kann den Interzept ebenfalls reduzieren. Im Falle von Fluoreszenz besteht die Möglichkeit, einen Schmalbandfilter in das Gerät einzubauen, der vorhandenes fluoreszierendes Licht entfernt.

DLS misst die zeitabhängigen Fluktuationen in der Intensität des gestreuten Lichts und daher basieren die grundlegenden Informationen, die durch die Technik gewonnen werden, auf der Intensität des gestreuten Lichts. Der z-gewichtete Durchmesser ist der intensitätsgewichtete mittlere Durchmesser, der aus der Kumulantenanalyse gemäß ISO22412 (2017) erhalten wird, und die primäre Größenerteilung basiert auf der Intensität.

Obwohl die Umwandlung der gemessenen Intensitätsverteilung in Volumen oder Anzahl einfach erscheint, wird DLS-Nutzern dringend geraten, die Ergebnisse nicht übermäßig zu analysieren. Die DLS-Technik neigt dazu, die Breite der Peaks in der Verteilung zu überschätzen, und dieser Effekt wird in den Umwandlungen zu Volumen und Anzahl verstärkt. Die Volumen- und Zahlengrößenverteilungen sollten nur zur Abschätzung der relativen Mengen an Material in separaten Peaks verwendet werden, da die Mittelwerte und besonders die Breiten weniger zuverlässig sind. Daher wird empfohlen, die Verteilung der Intensitätsgrößen zur Berichterstattung über die Größe jedes Modus in der Verteilung zu verwenden, aber die Volumen- oder Zahlenangaben zu nutzen, um die relativen Mengen jeder Partikelfamilie in der Probe zu berichten.

Die dynamische Lichtstreuung misst die zeitabhängigen Fluktuationen in der Streulichtintensität, welche die Bestimmung der translationalen Diffusionskoeffizienten (d. h. Brownsche Bewegung) und damit die Größe von Partikeln/Molekülen ermöglicht.

Die statische Lichtstreuung misst die zeitlich gemittelte Intensität im gestreuten Licht. Im Zetasizer-Produktreihe, wird die zeitlich gemittelte Intensität des gestreuten Lichts als Funktion der Probenkonzentration (d. h. molekulare Lösungen) gemessen, und daraus wird das absolute Molekulargewicht einer makromolekularen Lösung bestimmt. In der Mastersizer-Produktreihe wird die zeitlich gemittelte Intensität des gestreuten Lichts als Funktion des Winkels gemessen, was die Bestimmung der Partikelgröße ermöglicht.

Die Antwort auf diese Frage ist ja, das kann er. DLS geht davon aus, dass die gemessenen Partikel/Moleküle sich in einem zufälligen, brownschen Bewegungszustand befinden. Dies gilt bei einer verdünnten Probenkonzentration. Mit zunehmender Probenkonzentration können jedoch andere Effekte auftreten, wie Mehrfachstreuung, eingeschränkte Diffusion und Partikel-Partikel-Interaktionen. Während der Einfluss der Mehrfachstreuung durch Rückstreudetektion und Messungen nahe an der Wand der Küvette minimiert werden kann, sind eingeschränkte Diffusion und Partikel-Partikel-Interaktionen schwieriger zu verstehen. Normalerweise kann eingeschränkte Diffusion durch Verwendung der Viskosität der Probe statt des Dispergiermittels kompensiert werden. Partikel-Partikel-Interaktionen sind wesentlich komplexer und können nicht kompensiert werden.

Die durch eine DLS-Messung erhaltene Größe sollte unabhängig von der Probenkonzentration sein (ISO22412 (2017)). Wenn jedoch die für eine Probe erhaltene Größe von der Konzentration der Probe abhängt, sollte eine Verdünnungsreihe durchgeführt werden, und der gemessene Diffusionskoeffizient jeder Probenkonzentration sollte als Funktion der Konzentration geplottet und die Daten auf Nullkonzentration extrapoliert werden. Der bei Nullkonzentration erhaltene Wert ist der wahre Diffusionskoeffizient (d. h. mittlere Größe) der Probe. Dies wird als dynamisches Debye-Diagramm bezeichnet und in ISO22412 (2017) diskutiert. Wenn Sie den erweiterten Protein-Feature-Key mit Ihrer Zetasizer-Software installiert haben, enthalten die Rechner ein dynamisches Debye-Diagramm.

Ich habe einige Dokumente beigefügt, die die Konstrationseffekte detaillierter erläutern.
Anwendung der dynamischen Lichtstreuung (DLS) auf proteintherapeutische Formulierungen: Prinzipien, Messungen und Analyse – 2. Konzentrationseffekte und Partikelinteraktionen
FAQ – Was ist Mehrfachstreuung?
FAQ – Was ist eingeschränkte Diffusion?

Die untere Größenbegrenzung der dynamischen Lichtstreuung hängt von vielen Faktoren ab, wie der optischen Konfiguration des Instruments, Wellenlänge/Leistung des Lasers, Empfindlichkeit des Detektors, Probenkonzentration und dem Überschuss an Streuung. Letzterer Punkt ist der Unterschied in der Streuung zwischen dem verwendeten Dispergiermittel und den darin enthaltenen Molekülen/Partikeln. Je höher der Grad der überschüssigen Streuung, desto einfacher ist die Messung. Die kleinste Größe, die wir auf einem Zetasizer gemessen haben, ist 0,6 nm (Peak-Modus), und ich habe eine Anwendungshinweis beigefügt, die Details zu solchen Messungen enthält.

Anwendungshinweis “Messung von Subnanometer-Größen mit dynamischer Lichtstreuung“

Dies bedeutet normalerweise, dass Ihre Probe sehr große Partikel/Aggregate/Staub enthält, die eine Störung der Messungen verursachen. Wir bezeichnen dies als Zahlenschwankungen, und ich habe eine FAQ beigefügt, die dies detaillierter erklärt. Was sicher ist, ist, dass die Probe für DLS ungeeignet ist und das große Material vor der Messung entfernt werden muss.

FAQ – Was sind Zahlenschwankungen?