Aggregations­temperatur (Tagg) – was ist das und wie können wir sie berechnen?

Messung der Aggregations­temperatur mit dem Zetasizer

Bei der dynamischen Lichtstreuung (DLS) können die hydrodynamische Größe und Verteilung der Partikelgrößen in Lösungen ermittelt werden. Es kann interessant sein, diese Messung als Funktion von Zeit und Temperatur oder als sogenannten ‚Trend‘ zu untersuchen, wie es in der Malvern Zetasizer-Software genannt wird. Für biologische Proteinproben ist dieser Temperaturtrend besonders interessant: Obwohl ein Protein bei niedrigen Temperaturen stabil sein und wiederholbare Größen- (und Streuintensitäts-) Messungen zeigen kann, neigen Proteinmoleküle bei einer bestimmten erhöhten Temperatur (T_agg) zur Oligomerbildung oder Aggregation. Die Temperatur, bei der dies geschieht, hängt vom Protein selbst sowie von der Pufferzusammensetzung ab und wird normalerweise nur dann deutlich beobachtet, wenn das Ausgangsprotein zu Beginn der Messung homogen ist.

Ein Beispiel, das die Stabilität von rekombinantem Humanalbumin diskutiert, wird in der Anwendungsnote „Verwendung der Lichtstreuung zur Untersuchung der thermischen Stabilität von Recombumin – Vorhersage der Haltbarkeit“ behandelt.

Wie wird T_agg bestimmt?

Die traditionelle Methode zur Bestimmung der Aggregations­temperatur T_agg bestand darin, die normalisierte Intensität gegen die Temperatur zu betrachten. Der Aggregations­punkt war der erste Punkt, an dem die Steigung größer als 10 war, wobei die Steigung die vorherigen 5 Datenpunkte einbezog. Diese Methode konnte modifiziert werden, um stattdessen die z-durchschnittliche Größe oder sogar den Polydispersitäts-Index zu betrachten. Die aktuelle Software enthält zwei Anpassungsalgorithmen:

• Einstufen- (nur Zählrate) Analyse
• Mehrstufen- (Größe und Zählrate) Analyse

Die Mehrstufen­anpassung berücksichtigt sowohl die Änderung in der hydrodynamischen (z-durchschnittlichen) Größe als auch die (abgeleitete) Streuzählrate und ist die bevorzugte Methode. Ein Screenshot aus der aktuellen Software zeigt einen typischen Unterschied zwischen den beiden Analysemethoden.

Als Beispiel für den Hämoglobin-Aggregations­temperaturpunkt, der in der Example Results.dts-Datei bereitgestellt wird, gab die alte Einstufen-Methode ein Ergebnis von 38ºC, während die neue Mehrstufen­methode ein Ergebnis von 42ºC ergab. Die absolute Änderung ist nicht von großer Bedeutung, solange dieselbe Methode verwendet wird, wenn verschiedene Datensätze verglichen werden. Um dieses Menü für einen beliebigen Datensatz anzuzeigen, markieren Sie einen Eintrag, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Ergebnis bearbeiten.

Warum unterscheidet sich T_agg von T_melt?

Die Aggregations­temperatur erfasst den Beginn der Aggregation; die Temperatur, bei der Moleküle zur Aggregation neigen. Die Schmelztemperatur, T_melt oder T_m, hingegen, ist das Ergebnis einer (fast) vollständigen Denaturierung des Proteins. Sie kann beispielsweise durch differentielle Scanningkalorimetrie (DSC) oder durch zirkulare Dichroismus (CD) bestimmt werden, was kleine Änderungen in der Wärmekapazität und der Gesamtstruktur detektiert. Aufgrund der extremen Empfindlichkeit der Lichtstreuung auf kleine molekulare Größenänderungen und den Beginn der Oligomerbildung wird die Aggregations­temperatur (T_agg) typischerweise als niedriger als die Schmelztemperatur (T_melt) wahrgenommen.

Wie richtet man eine Messung für T_agg ein?

Der Zetasizer ermöglicht automatisierte Trendmessungen gegenüber der Temperatur. Um auf das Menü zuzugreifen, starten Sie entweder eine manuelle Messung oder erstellen Sie ein SOP. Wählen Sie dann in der oberen linken Ecke des Fensters Messtyp – Trend – Temperatur – Größe, um mit einigen Standardeinstellungen zu beginnen. Gehen Sie die Menüpunkte durch, insbesondere die Trendsequenz, bei der die Anfangs- und End sowie das Temperaturintervall eingegeben werden können. Setzen Sie ein Häkchen neben „Aggregations­punkt prüfen“. Unter den Einstellungen für „Größenmessung“ geben Sie die Gleichgewichts­zeit bei jedem Schritt an. Ich empfehle, ein Häkchen neben „Ergebnisse zur Speicherung von nur Korrelations­daten zulassen“ zu setzen. Dies speichert auch Daten, wenn die Probe stark aggregiert ist (d. h. über die Aggregations­temperatur hinaus) und kann nützlich sein.

Das SOP schätzt die Experiment­länge und diese wird sowohl in den Trend- als auch in den Größenmessungs­abschnitten angezeigt (es kann erforderlich sein, auf etwas anderes zu klicken, um die Berechnung zu aktualisieren). Das SOP oder die manuelle Messung kann dann wie eine normale Messung gestartet werden.

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