Beste Praktiken für Isotherme Titrationskalorimetrie zur Untersuchung von Bindungsinteraktionen – Teil 3

von Verna Frasca, Tuesday, 19th March 2019

Hier sind einige bewährte Praktiken für die Durchführung traditioneller Bindungsexperimente mit den MicroCal PEAQ-ITC, VP-ITC und iTC200-Systemen. Dies ist eine Fortsetzung der vorherigen Blogs „Beste Praktiken für Isotherme Titrationskalorimetrie zur Untersuchung von Bindungsinteraktionen“ Teil 1 und Teil 2.

Führen Sie regelmäßige Leistungs- und Validierungsprüfungen an Ihrem ITC durch

  • Wasser-zu-Wasser-Injektionen
  • ITC-Testkit mit RNase und EDTA
  • Ein weiteres Referenzbindungsassay

Führen Sie vor Bindungsexperimenten wann immer möglich Kontrolltitrationen durch

  • Überprüfen Sie die Verdünnungswärmen und andere Wärmeänderungsquellen
  • Die typische Kontrolltitration ist der Ligand in der ITC-Spritze, titriert in ein abgestimmtes Puffer- unter Verwendung der gleichen ITC-Experimentparameter wie das Bindungsexperiment
  • Die Wärmeänderungen für die Kontrolltitration sollten gering, reproduzierbar und ähnlich den Wärmeänderungen am Ende des Bindungsexperiments sein (Abbildung 1, oben)
  • Andere Kontrolltitrationen sind Puffer-in-Puffer und Puffer-in-Makromolekül in der ITC-Zelle

Abbildung 1: (oben) Rohdaten des ITC, mit der Kontrolltitration (Ligand in Puffer) (rot) und dem Bindungsexperiment (Ligand in Makromolekül) (schwarz). Beachten Sie, dass die Spitzen der Kontrolltitration in Form und Größe den letzten Injektionen des Bindungsexperiments ähneln.

(unten) Normierte Wärmeänderungen mit der Kontrolltitration (rot) und dem Bindungsexperiment (schwarz). Daten passen zum Bindungsmodell mit einem Satz von Bindungsstellen.

Bewertung von ITC-Rohdaten: Wie sehen die Rohdaten für ein ideales ITC-Experiment für ein (1:1 Bindungsereignis) aus?

Siehe Abbildungen 1 und 2.

  • Das Titrationsdatenplot beginnt als eine Reihe von etwa gleich großen, großen Spitzen (exotherm oder endotherm), die ungefähr 100 % Bindung des Liganden an das Makromolekül darstellen
  • Die Wärmeänderungen werden reduziert, wenn die Bindungsstellen durch weitere Injektionen von Liganden während des Experiments gesättigt werden
  • Die letzten Spitzen, die den Verdünnungswärmen des Liganden entsprechen, nachdem die Bindung vollständig gesättigt ist, sollten klein und reproduzierbar sein (Abbildungen 1 und 2)
  • Diese Art von Titrationskurve wird zu einer sigmoiden Bindungsisotherme führen (Abbildung 1 unten)
  • Es ist eine ausreichende Wärmeänderung über dem Basisrauschen für qualitativ hochwertige ITC-Daten erforderlich
  • Injektionswärmen (integrierter Bereich):
    • Für PEAQ-ITC und ITC200: >2.5 ucals für den zweiten (ersten vollen) Peak sind ideal
      • ~1 ucals für den zweiten Peak ist die minimale Wärme für die Datenanalyse
    • Für VP-ITC: >10 ucals für den zweiten (ersten vollen) Peak sind ideal
      • ~3-5 ucals für den zweiten Peak ist die minimale Wärme für die Datenanalyse
    • Unterhalb dieses Wärmeerfassungsbereichs können die Daten durch ein niedrigeres Signal/Rausch-Verhältnis rauschbehafteter sein
  • Die Basislinienposition (in ucal/sec) für die Rohdaten des ITC sollte innerhalb von 1 ucal/sec der Referenzleistungseinstellung liegen. Ist der Unterschied größer als 1 ucal/sec, kann das auf eine verschmutzte ITC-Zelle und/oder Blasen in der Referenz- oder Probenzelle hinweisen
  • Alle DP-Werte (Y-Achse) der Roh-ITC-Daten sollten über 0 ucal/sec liegen
  • Die Position der Basislinie nach Injektion sollte dieselbe sein wie die Basislinie vor der Injektion. Wenn nicht, könnte die Zeit zwischen den Injektionen nicht ausreichen oder es gibt einen anderen Prozess, der eine Änderung von DP verursacht, wie z.B. enzymatische Hydrolyse
  • Ein leichter Drift der Basislinie während der Titration ist normal. Wenn es eine gute Integrationsbasislinie gibt, sind die Daten in Ordnung (Abbildung 2). Sie möchten keine großen Sprünge in der Basislinie oder „Stufen“.

Abbildung 2. Hochwertige ITC-Daten. Beachten Sie den leichten Drift in der Integrationsbasislinie (in rot) – dies ist akzeptabel.

Mehr Informationen über den N-Wert aus ITC-Kurvenanpassung

N ist mit der Gesamtmakromolekülkonzentration verbunden und ist einer der Parameter, der während der Datenanalyse bestimmt wird. Es ist wichtig zu verstehen, dass der ITC-Wert N NICHT immer dasselbe ist wie die Stöchiometrie (Bindungsverhältnis) der Ligandenbindung an das Makromolekül. Der N-Wert entspricht tatsächlich der Stöchiometrie, wenn die für die Anpassung verwendeten Konzentrationen korrekt und 100 % aktiv sind.

Eine andere Möglichkeit, den N-Wert auszudrücken, ist diese Gleichung:

N = St x [AFcell/AFsyr]

Wobei St die Stöchiometrie ist (Anzahl der Bindungsstellen, die das Makromolekül für den Liganden hat), AF der „aktive Anteil“ des Biomoleküls (die aktive Konzentration geteilt durch die Gesamtkonzentration), AFcell ist der aktive Anteil der Probe in der Zelle (typischerweise das Makromolekül) und AFsyr ist der aktive Anteil der Probe in der Spritze (typischerweise der Ligand).

Jeder der drei Werte in dieser Gleichung kann N ändern, was bedeutet, dass N sowohl das Bindungsverhältnis als auch die Aktivität der Probe(n) misst. Zwei dieser Werte müssen bekannt (oder angenommen) sein, um den dritten zu erhalten. Beispielsweise, wenn jemand an der Stöchiometrie interessiert ist, müssen die im Fit bereitgestellten Konzentrationen genau und 100 % aktiv sein. Wenn jemand an der Aktivität der Probe in der Zelle (oft das Makromolekül) interessiert ist, müssen die Stöchiometrie und die aktive Konzentration der Probe in der Spritze (Ligand) angenommen werden.

Im PEAQ-ITC-Datenanalysetool können Sie die Daten auch durch Festlegung von N auf 1 (oder den gewünschten Wert) und Variation der Zell- oder Spritzenkonzentration anpassen.

Wenn N niedriger als die erwartete Stöchiometrie ist, ist Ihre aktive Makromolekülkonzentration in der Zelle geringer als die Gesamtkonzentration, und/oder Ihre aktive Ligandenkonzentration ist höher als die Gesamtkonzentration.

Wenn N 0,5 beträgt, ist es möglich, dass Ihr Makromolekül (in der ITC-Zelle) ein Dimer ist und ein Ligand pro Dimer bindet. Es ist auch möglich, dass Ihr Biomolekül in der Spritze zwei Bindungsstellen hat und die Probe in der Zelle eine. In diesem Fall sollten Sie versuchen, die Bindungskurve mit der Option „Ligand in Zelle“ zu fitten.

Wenn N höher als die erwartete Stöchiometrie ist, dann ist Ihre aktive Makromolekülkonzentration in der Zelle größer als die Gesamtkonzentration, und/oder Ihre aktive Ligandenkonzentration ist niedriger als die Gesamtkonzentration.

Fehler in der Ligandenkonzentration in der Spritze führen zu Messfehlern von N, KD und ΔH und somit zu den berechneten freien Energien (ΔG) und entropischen (-TΔS) Beiträgen zur Bindung. Fehler in der Makromolekülkonzentration in der Zelle betreffen in erster Linie die Genauigkeit des ermittelten N-Werts.

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