Beste Praktiken für isotherme Titrationskalorimetrie zur Untersuchung von Bindungsinteraktionen – Teil 4

von Verna Frasca, Thursday, 18th April 2019

Hier sind einige bewährte Verfahren zur Durchführung traditioneller Bindungsexperimente mit den MicroCal PEAQ-ITC, VP-ITC und iTC200 Systemen. Dies ist eine Fortsetzung der vorherigen Blogs ‚Beste Praktiken für isotherme Titrationskalorimetrie zur Untersuchung von Bindungsinteraktionen‘ Teil 1, Teil 2 und Teil 3.

Häufige Probleme mit ITC-Rohdaten und mögliche Ursachen

  • Hohe Injektionswärmen, aufgrund großer Verdünnungswärmen:

    • Dies liegt typischerweise an einem Missverhältnis der Makromolekül- und Ligandenlösungen, das viel größer ist als die tatsächliche Bindungswärme.
    • Die Bindungsisotherme sieht oft wie eine gerade Linie aus, ohne Hinweise auf Bindungssättigung.
    • Typischerweise kann diese große Wärmeänderung nicht durch die Subtraktion einer Kontrolltitration korrigiert werden.

  • DP kehrt nicht zum Ausgangsbaseline vor der nächsten Injektion zurück.

    • Dies kann auf unzureichende Zeit zwischen den Injektionen zurückzuführen sein, um die vollständige Messung der Bindungswärme zu ermöglichen.
    • Nicht alle Wärmeänderungen werden pro Injektion gemessen, was die Datenqualität beeinflusst. Passen Sie das Injektionsvolumen an, reduzieren Sie die Ligandenkonzentration und/oder erhöhen Sie die Zeit zwischen den Injektionen.
    • Wenn Sie diesen Effekt während des Experiments bemerken, können Sie das Intervall zwischen den Injektionen für die verbleibenden Injektionen erhöhen.
    • Es kann auch einen anderen (langsameren) Prozess geben, der eine Wärmeänderung verursacht, wie z.B. Konformationsänderungen.

  • Spitzen in den Injektionen, einige Peaks sind viel größer (oder viel kleiner) als andere:

    • Verursacht durch Blasen in der ITC-Zelle und/oder Spritze oder eine schmutzige oder beschädigte Kolbenspitze im ITC-Injektor.

  • Rauschendes Baseline und/oder Spitzen zwischen den Injektionen:

    • Luftblasen aufgrund schlechter Zell- und/oder Spritzenfüllung, schmutzige Zellen und/oder Spritzen.
    • Kann auch auf eine verbogene Injektionsnadel oder ein Problem mit dem Injektionssystem zurückzuführen sein.

  • Springendes Baseline: Es gibt eine Änderung der Wärmeleistung des Systems aufgrund von enzymatischer Hydrolyse, pH- oder Puffer-Missverhältnis:

    • Wenn Sie die Bindung zwischen Substrat und Enzym untersuchen, verwenden Sie ein nicht hydrolysierbares Substrat.
    • Das springende Baseline kann auch durch Blasen in der ITC-Zelle oder Spritze verursacht werden, aufgrund unzureichender Füllung.

  • Keine nachweisbare Bindungswärme:

    • Es gibt keine Bindung.
    • Es ist möglich, dass eine Bindung stattfindet und die Wärmeänderung zu gering ist. Die Bindungsenthalpie kann niedriger als erwartet sein, und/oder die Bindungsaffinität ist schwächer als erwartet.
    • Um die Wärmeänderung/Injection zu erhöhen, müssen Sie die Konzentration von Makromolekül und/oder Ligand erhöhen; das Injektionsvolumen erhöhen und/oder die experimentellen Bedingungen ändern, wie die Versuchstemperatur oder den Puffer/pH.

Korrektur der Verdünnungswärme vor der Datenanalyse

  • Wie in den vorherigen Blogs besprochen, ist eine enge Abstimmung der Makromolekül- und Ligandenlösungen entscheidend, um große Verdünnungswärmen zu vermeiden, die das tatsächliche Bindungssignal verschleiern könnten. Diese nicht-bindungsbezogenen Wärmen müssen von jedem Punkt in der Makromolekül-Liganden-Titrationsbindung-Isotherme subtrahiert werden, bevor weitere Datenanalysen durchgeführt werden können. Dies kann auf mehrere Arten erreicht werden:
  • Eine Schätzung der Verdünnungswärme kann direkt aus der experimentellen Titration erhalten werden, indem die integrierten Wärmen der letzten Injektionen gemittelt werden. Diese Subtraktion kann mit der „Einfachen Mathematik“-Option in der Origin-Datenanalyse durchgeführt werden. Diese Methode geht davon aus, dass die Bindungsstellen bis zum Ende des ITC-Experiments vollständig mit Ligand gesättigt sind.
  • Für PEAQ-ITC kann die Option „fitted offset“ während der Datenanalyse zur Korrektur der Verdünnungswärme verwendet werden.
    • Wenn Sie eine Kontrolltitration der Ligandenlösung in den Puffer haben, können Sie eine Punkt-für-Punkt-Subtraktion der integrierten Peak-Werte von dieser Kontrolle von denen im Experiment durchführen. Bei geringen Bindungswärmen könnte diese Korrektur zu einer rauschigeren Bindungsisotherme führen, im Vergleich zur Subtraktion einer Konstante.
  • Beachten Sie, dass die Kontrolltitration reproduzierbare Injektionswärmen während der Titration und ein lineares Diagramm ohne oder mit einer flachen Steigung ergeben sollte (Abbildung 1).
  • Statt einer Punkt-für-Punkt-Korrektur können Sie eine Linie erstellen oder eine mittlere Injektionswärmeänderung für die Kontrolltitration ermitteln und von den experimentellen Daten subtrahieren.
  • Wenn die letzten Injektionen der experimentellen Bindungskurve eine von Null abweichende Steigung aufweisen und/oder die Kontrolltitration nicht linear ist oder eine große Steigung hat, sollten Sie die möglichen Gründe für solche Ergebnisse erwägen und ob dies angemessen korrigiert werden kann.
  • Nachdem die Verdünnungswärmen durch eine dieser Methoden berücksichtigt wurden, sollte die Bindungsenthalpie bei Sättigung gegen Null tendieren und die Bindungsisotherme kann mit einem geeigneten Modell zur Bestimmung der Bindungsparameter gefittet werden.

Abbildung 1: Rohdaten der ITC, mit der Kontrolltitration (Ligand in Puffer) (rot) und dem Bindungsexperiment (Ligand in Makromolekül) (schwarz). Beachten Sie, dass die Peaks der Kontrolltitration in Form und Größe den letzten Injektionen des Bindungsexperiments ähneln.

Abbildung 1: Normalisierte Wärmänderungen, mit der Kontrolltitration (rot) und dem Bindungsexperiment (schwarz). Die Daten werden auf das Ein-Set-von-Orten-Bindungsmodell gefittet.

Optimierung von ITC-Experimenten, nach den ersten Experimenten

  • Es ist möglich, die Form der Bindungsisotherme zu verschieben und zu ändern, indem die Konzentration der Zellprobe und/oder der Spritzenprobe angepasst wird, um die Qualität der erhaltenen Daten zu optimieren. Sie können auch das Injektionsvolumen und die Anzahl der Injektionen ändern. Wenn Sie vorläufige Daten haben, können Sie den „Design Experiment“-Wizard mit erweiterten Optionen oder ein anderes ITC-Datensimulationstool verwenden, um Bindungsisothermen zu simulieren und zukünftige Experimente zu entwerfen.
  • Es ist möglich, dass Sie die „optimale“ Konzentration(en) für Ihre Bindung nicht verwenden können: Sehr niedrige Reaktantenkonzentrationen können zu einem zu kleinen experimentellen Signal führen (das von ΔH der Bindung abhängt), während sehr hohe Konzentrationen einfach unpraktisch oder unmöglich zu erreichen sind für Biopolymere (z.B. wenn ein Protein dazu neigt, bei hoher Konzentration zu aggregieren).
  • Wenn Sie nicht in der Lage sind, die Ligandenkonzentration hoch genug zu bekommen, um eine Bindungssättigung nach der Injektion der Spritzenvolumeninhalte zu erreichen, können Sie den Makromolekül-Ligand-Komplex in der ITC-Zelle behalten, die Spritze mit mehr Ligand füllen und ein zweites Titrationsexperiment durchführen. Dies kann wiederholt werden, bis die Bindungssättigung erreicht ist.
    • Um die Daten zu fitten, verwenden Sie das Concatenation-Softwaretool, um zwei (oder mehr) ITC-Datendateien zusammenzufügen
    • Download MicroCal ITC Concatenation-Software
  • Was passiert, wenn die Bindungsaffinität und die Makromolekülkonzentration zu einem C-Wert führen, der außerhalb des optimalen Bereichs liegt? Bei sehr engen Bindungsreaktionen (wo Bedingungen von C> 1000 wahrscheinlich sind) können nur ΔH und N direkt aus einem ITC-Experiment genau bestimmt werden. Zusätzliche Ansätze, wie die Verwendung eines Verdrängungs-/Konkurrenzexperiments mit einem schwach bindenden, vorgebundenen Ligand, können es dem Benutzer jedoch immer noch ermöglichen, einen KD zu bestimmen.
  • Bei schwachen Bindungsereignissen kann es immer noch möglich sein, nützliche Daten im „niedrigen C-Bereich“ (C-Werte unter 1-5) zu erhalten, indem eine sehr hohe Konzentration von Ligand verwendet wird, um die Bindung fast zur Sättigung am Ende der Titration zu treiben. In diesem Szenario neigen die Bindungsisothermen dazu, nicht sigmoidal zu sein, und es kann erforderlich sein, N während des Fittings zu fixieren, sodass nur die Bindungsaffinität mit Vertrauen gemessen werden kann. ΔH wird vom Experiment nicht gut definiert. Wenn N jedoch mit Vertrauen bekannt ist und bei Bedarf in der Fit-Prozedur fixiert werden kann, können solche Experimente dennoch sehr aufschlussreich sein. Sie können auch ein Verdrängungs-/Konkurrenzexperiment durchführen, das für die Charakterisierung schwacher Binder konzipiert ist.

Relevante Inhalte

Frühere Beiträge

 

Dieser Artikel wurde möglicherweise automatisch übersetzt