Beste Vorgehensweisen für die isotherme Titrationskalorimetrie zur Untersuchung von Bindungsinteraktionen – Teil 1

Hier sind einige bewährte Praktiken für die Durchführung traditioneller Bindungsexperimente mit den MicroCal PEAQ-ITC-, VP-ITC– und ITC200-Systemen.   

Probenanforderungen:

• • Konventionell ist das „Makromolekül“ das Biomolekül in der isothermen Titrationskalorimetriezelle (ITC), und der „Ligand“ ist das Biomolekül in der ITC-Spritze. Diese können beliebige Moleküle (Protein, Nukleinsäure, kleiner Molekülinhibitor, Metall, etc.) sein, die miteinander interagieren. Auch „umgekehrte Titrationen“ können durchgeführt werden, mit dem „Ligand“ in der Spritze.
  • Der „Ligand“ hat eine Bindungsstelle, zum Zweck der Datenanalyse im Modell der Bindung eines Satzes von Stellen und anderen häufig verwendeten ITC-Datenanalysemethoden. Das „Makromolekül“ kann eine beliebige Anzahl von Bindungsstellen haben.
  • Alle Proben sollten für ITC so rein wie möglich sein. Chemische und konformationelle Verunreinigungen sollten vermieden oder eliminiert werden, da diese die genaue Konzentrationsbestimmung beeinflussen und möglicherweise an der Bindungsinteraktion beteiligt sein oder diese stören können.
  • Für qualitative hochwertige ITC-Daten müssen beide Biomoleküle im gewünschten Puffer übereinstimmen, um Wärmeänderungen durch ausgeglichene Pufferung zu vermeiden.

• Puffer für ITC:
  • Verwenden Sie einen Puffer, der die Löslichkeit und Stabilität der Biomoleküle aufrechterhält, und schließen Sie alle notwendigen Salze, Cofaktoren und Zusatzstoffe ein, die für die Bindung erforderlich sind.
  • Als Ausgangspunkt können Sie den gleichen Puffer verwenden, der für andere Bindungsstudien eingesetzt wurde.
  • ITC ist kompatibel mit wässrigen Puffern im Bereich von pH2-PH12. Stellen Sie sicher, dass die Pufferkonzentration ausreicht, um den pH-Wert in Gegenwart der Biomoleküle zu halten.
  • Wenn der Puffer Glycerol (oder eine andere viskose Komponente) enthält, halten Sie die Glycerolkonzentration unter 20% (v/v), um Blasen in der ITC-Zelle und der Injektionsspritze zu vermeiden.
  • Wenn der Puffer ein Tensid oder Detergens enthält, halten Sie die Tensidkonzentration unter seiner kritischen Mizellkonzentration (CMC), es sei denn, Sie untersuchen Mizellen mit ITC.
  • Falls ein Reduktionsmittel erforderlich ist, empfehlen wir die Verwendung von TCEP oder 2-Mercaptoethanol. Dithiothreitol wird nicht empfohlen.
  • Wenn ein Ligand DMSO zur Löslichkeit benötigt, stellen Sie sicher, dass Sie die gleiche endgültige DMSO-Konzentration in beiden Bindungspartnern haben. Die empfohlene Obergrenze ist 10% DMSO für ITC-Bindungsstudien.
  • Wenn Sie ein anderes organisches Lösungsmittel verwenden müssen, sehen Sie in der technischen Literatur des Instruments nach oder konsultieren Sie Ihr regionales Malvern Panalytical Support-Team, um Empfehlungen und die chemische Verträglichkeit Ihres ITC-Systems zu erhalten.

Probenvolumina:

• Siehe Tabelle 1. Dies sind die empfohlenen Volumina, die erforderlich sind, um die ITC-Zelle und die Spritze mit empfohlenen Protokollen zu füllen, ohne dass Blasen entstehen.

Probenkonzentrationen:

• Die Ausgangskonzentration des Makromoleküls in der ITC-Zelle wird typischerweise durch den „C-Parameter“ oder den „Sigmoiditätsfaktor“ bestimmt:
  C= N[M]_T/K_D       
• [M]T ist die Makromolekülkonzentration in der ITC-Zelle, und N ist die Stöchiometrie. Um ein vernünftiges ITC-Bindungsisotherm zu erhalten, liegt der optimale Bereich bei 5 < C < 500. In vielen Fällen können Sie einige nützliche Daten von einer ITC-Bindungskurve erhalten, wenn C zwischen 1 und 1000 liegt.
• Für eine 1:1-Bindung beginnen Sie mit einer 10-fach höheren Ligandenkonzentration in der ITC-Spritze im Vergleich zur Makromolekülkonzentration in der ITC-Zelle.
• Wenn Sie einen geschätzten K_D haben und eine 1:1-Bindung vorliegt, verwenden Sie die Anleitung in Tabelle 2. Vorausgesetzt, es gibt eine vernünftige Wärmeänderung und Bindungsenthalpie, sollten diese Konzentrationsbereiche eine Bindungskurve ergeben.
• Wenn K_D unbekannt ist, versuchen Sie es mit 20 μM Probe in der ITC-Zelle und 200 μM Probe in der ITC-Spritze.
• Minimalkonzentration in der ITC-Zelle: 5-10 μM
• Minimalkonzentration in der ITC-Spritze: 50 μM

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