Best Practices für die Isotherme Titrationskalorimetrie zur Untersuchung von Bindungsinteraktionen – Teil 2

Hier ist der zweite Best Practices-Blog für die Durchführung traditioneller Bindungsexperimente mit den MicroCal PEAQ-ITC, VP-ITC und ITC200 Systemen.

Hier ist der erste Teil: Best Practices für ITC zur Untersuchung von Bindungsinteraktionen – Teil 1

Vorbereitung der ITC:

• Führen Sie eine visuelle Inspektion des ITC-Systems durch und überprüfen Sie lose Kabelverbindungen, beschädigte Injektionsspritzen, undichte Schlauchverbindungen, Verfärbungen um die Zelle usw.
• Stellen Sie sicher, dass Wasser in die ITC-Referenzzelle eingefüllt wird und wechseln Sie das Wasser regelmäßig während der Nutzung der ITC (einmal pro Woche wird empfohlen)
• Stellen Sie sicher, dass die ITC und der Controller eingeschaltet sind, die Steuersoftware geöffnet ist, das Instrument online ist und das Instrumententhermostat auf die Experimentiertemperatur eingestellt ist.
  • MicroCal ITCs können unbegrenzt eingeschaltet bleiben und bei 25 °C thermostatisiert werden
• Reinigen Sie die ITC-Zelle und -Spritze nach dem empfohlenen Reinigungsprotokoll und mit den empfohlenen Reagenzien
  • Empfohlen wird, die ITC-Zelle nach jedem ITC-Experiment mit 20% Contrad 70/14% Decon 90 und anschließend mit Wasser zu spülen.
  • Führen Sie regelmäßige „Einweichungen“ mit 20% Contrad 70/14% Decon 90 in der ITC-Zelle durch, erhitzt auf 60 °C, für mindestens 30 Minuten. Kühlen Sie die Zelle ab und spülen Sie mit Wasser. Wenn Sie mit einem klebrigen Protein oder einem anderen Biomolekül arbeiten, müssen Sie möglicherweise häufiger mit Detergens einweichen.
  • Stellen Sie sicher, dass die ITC-Spritze mit Methanol gespült und getrocknet ist, bevor der Ligand hinzugefügt wird.
  • Sie können die ITC-Spritze auch mit mehreren Volumina der Ligandenlösung spülen.
• Befüllen Sie die ITC-Zelle und -Spritze nach den empfohlenen Füll- und Ladeprotokollen. Es ist nicht erforderlich, die Proben zu entgasen, wenn der PEAQ-ITC und der ITC200 verwendet werden
  • Spülen Sie die ITC-Zelle mit dem Probenpuffer, bevor Sie die ITC-Zelle mit der Probe füllen.

ITC Einstellungen:

• Wenn ITC-Daten zur Screening und zum Vergleich von Affinität und thermodynamischen Parametern verwendet werden, stellen Sie sicher, dass alle experimentellen Designeinstellungen gleich sind, einschließlich Temperatur, Rückkopplungsmodus und Injektionsbedingungen.
• Siehe Tabelle 1 für die empfohlenen Einstellungen.

Für automatisierte MicroCal PEAQ-ITC und Auto iTC200 Systeme:

• Stellen Sie sicher, dass die Proben vor der ITC-Analyse bei einer geeigneten Temperatur gelagert werden. Für Proteine und andere Biomoleküle stellen Sie die Pufferaufbewahrungsschale auf 5 bis 10 °C. Wenn Sie mit einem thermostabilen Material arbeiten, können Sie die Schale auf 25 °C einstellen.
• Programmieren Sie Zell- und Spritzenreinigungen mit 20% Contrad 70 oder 14% Decon 90, unter Verwendung geeigneter Automations-Routinen und während regelmäßiger Wartungen.

Weitere Best Practices werden in zukünftigen Blogs veröffentlicht.

Relevanter Inhalt:

• Isotherme Titrationskalorimetrie: Theorie und Praxis
• Praktische Tipps für MicroCal PEAQ-ITC Experimente
• Bewältigung der Komplexität von Bindungsinteraktionen mit ITC – Holen Sie das Beste aus Ihren ITC-Daten heraus
• Biomoleküle: Proben- und Datenqualität bei der Interaktionsanalyse – Zwei Seiten derselben Medaille
• Werfen Sie Ihre „schlechten“ N-Wert ITC-Daten nicht weg
• Goldstandard für Bindungsaffinität

Frühere Beiträge:

• Best Practices für ITC zur Untersuchung von Bindungsinteraktionen – Teil 1
• Best Practices für ITC zur Untersuchung von Bindungsinteraktionen – Teil 3
• Best Practices für die Isotherme Titrationskalorimetrie zur Untersuchung von Bindungsinteraktionen – Teil 4
• Isotherme Titrationskalorimetrie – Ein heißes Werkzeug zur Charakterisierung biomolekularer Interaktionen
• Isotherme Titrationskalorimetrie: Ein wesentliches Instrument zur Messung der Bindungsaffinität in der Lebenswissenschaftsforschung
• Was gibt’s Neues bei ITC? Juni 2018 Ausgabe