Vergleich der mit TEM und DLS gemessenen Partikelgrößen

Messung des Latexstandards durch Dynamische Lichtstreuung (DLS)

Dynamische Lichtstreuung (DLS) ist eine nicht-invasive Technik, die sich zur Charakterisierung der Größe von Nanopartikeln und Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Proteinen und Polymeren, eignet. Diese Technik misst die zeitlichen Schwankungen der Streulichtintensität aufgrund der zufälligen Bewegung von Partikeln oder Molekülen, die der Brownschen Bewegung unterliegen. Die Geschwindigkeit dieser Brownschen Bewegung wird gemessen und Translationsdiffusionskoeffizient (D) genannt, der mittels der Stokes-Einstein-Gleichung [1-3] in den hydrodynamischen Durchmesser (D,_H) umgewandelt werden kann.

DLS ist eine absolute Technik, die auf Ersten Prinzipien basiert und daher keine Kalibrierung benötigt. Allerdings sollte zur Verifizierung des ordnungsgemäßen Betriebs regelmäßig eine Geräteüberprüfung durchgeführt werden.

Sphärisches Polymerlatex wird sehr häufig zur Überprüfung der Geräteleistung eingesetzt, da es als nahezu perfekt sphärische monodisperse Verteilung verfügbar ist. Eine Kugel ist die einzige dreidimensionale Form, deren Größe eindeutig durch ein Einzelbild beschrieben werden kann, was die Unsicherheiten hinsichtlich der Durchschnittsberechnung beseitigt.

Latex-Proben bieten andere Vorteile. Sie haben eine ähnliche Dichte wie Wasser, sodass Teilchen unter 1 Mikron während der Messung in Suspension bleiben. Die Dispersion kann bei Raumtemperatur aufbewahrt werden, die Haltbarkeit beträgt Monate bis Jahre.

Die Größennormmaterialien der Nanosphere 3000 Serie [3] werden jeweils mit einem Kalibrierungszertifikat geliefert, das durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) gemessen wurde, welches auf NIST [4] rückführbar ist. Die Normspezifikation umfasst auch den durch DLS gemessenen hydrodynamischen Durchmesser.

Größennormmaterialien der Nanosphere 3000 Serie sind in einem Bereich von 20 nm bis 900 nm erhältlich. Die am leichtesten zu messende Größenspanne liegt zwischen 20 nm und 300 nm. Teilchen, die größer als 60 nm sind, sind ausreichend groß, um in einer für DLS geeigneten Verdünnung sehr reproduzierbare Ergebnisse zu liefern. Teilchen größer als 300 nm beginnen markante Änderungen in der Streuintensität aufgrund des Streuwinkels und der Norm zu zeigen, sodass der Winkel außer Acht gelassen werden kann.

Duke Standards 2000 und 4000 Serien sind auf NIST rückführbare Größennormmaterialien, die auch für DLS-Verifikationsanwendungen verwendet werden können und Größen über 1 Mikron umfassen.

Zertifizierte hydrodynamische Größe

Die auf der Nanosphere-Flasche angegebenen Ergebnisse sind die zertifizierten TEM-Ergebnisse.

DLS-Ergebnisse (d.h. hydrodynamische Größe) werden im bereitgestellten Spezifikationsblatt zitiert, sind jedoch keine zertifizierten Werte.

Bei allen Nanosphere 3000 Normmaterialien sollte die Größenpräzision durch DLS im Bereich ±2 % des spezifizierten hydrodynamischen Größenspektrums liegen für Proben, die in 10 mM NaCl vorbereitet wurden [2,3].

Natriumchlorid wird verwendet, um die elektrische Doppelschicht zu unterdrücken. Eine Verdünnung der Normmaterialien in deionisiertem Wasser lässt die Doppelschicht sich ausdehnen und die Größe künstlich vergrößern, was die Spezifikation überschreiten kann.

Vergleich der mit TEM und DLS gemessenen Größe

Verschiedene Messtechniken messen unterschiedliche Eigenschaften von Partikeln und können daher unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich der aus den gemessenen Eigenschaften abgeleiteten Größe liefern. Die häufig gestellte Frage lautet daher: Welches Ergebnis ist korrekt?

Für viele Menschen gilt „Sehen ist Glauben“, daher werden Elektronenmikroskop-Ergebnisse als „korrekt“ angesehen.

Tatsächlich werden Proben, die für die Elektronenmikroskopie vorbereitet werden, häufig intensiv behandelt, und diese Behandlungen können weiche Materialien wie Polymergitter verzerren und die Oberflächenstrukturen verändern oder verbergen.

Solche Behandlungen können es unmöglich machen, die Größe bestimmter Materialtypen wie Tensidmizellen zu messen. Im Gegensatz dazu misst DLS den hydrodynamischen Durchmesser der in ihrer nativen Umgebung verteilten Partikel.

Veränderungen der Oberflächenstruktur, wie etwa eine adsorbierte Polymerschicht oder die Änderung einer elektrischen Doppelschicht, die die Brownsche Bewegung der Partikel beeinflusst, ändern die effektive Partikelgröße [5].

Die Verwendung eines extrem niedrigen Salzdipersion ergibt eine Veränderung der Oberflächenstruktur oder eine Expansion der elektrischen Doppelschicht, die die Brownsche Bewegung verringert und die gemessene Größe erhöht. Aus diesem Grund ist die hydrodynamische Größe von Partikeln, die keine glatten und harten Kugeln sind, oder die DLS-Größe typischerweise größer als die TEM-Größe.

Tabelle: Zusammenfassung der DLS-Messungen, die an den Latexnormmaterialien durchgeführt wurden.

Diese Tabelle enthält Details zu den verwendeten Latexproben (Teilenummer in Klammern), den zertifizierten (#) oder hydrodynamischen (*) Größenbereichen, die Konzentration, bei der das Latex gemessen wurde, das zur Vorbereitung verwendete Verdünnungsmittel, das Gerät, mit dem die Messungen durchgeführt wurden, und den für jedes Latex erhaltenen z-Averagedurchmesser.

Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 1 fasst die Ergebnisse zusammen, die für verschiedene Latexstandards gemessen durch DLS erzielt wurden. Alle Standards haben zertifizierte Größenbereiche, aber einige zitieren auch hydrodynamische Größenbereiche. Der zertifizierte Größenbereich (#) wurde durch den Einsatz eines Transmissionselektronenmikroskops gewonnen und ist auf NIST rückführbar. Der hydrodynamische Größenbereich (*) wird durch DLS bestimmt.

Die Ergebnisse zeigen, dass ein breiter Konzentrationsbereich von Latexnormmaterialien gemessen werden kann. Die Rückstreu-Erkennung, die beim Zetasizer verwendet wurde, erlaubt es, einige Latexproben in unverdünnter Konzentration (z.B. 1 % w/v) zu messen.

Mit zunehmender Größe der Latexpartikel werden Zahlenschwankungs- und Sedimentationsprobleme bedeutender. Während einer DLS-Messung schwankt die Streulichtintensität aufgrund der Brownschen Bewegung der Partikel. Die Streuintensität ist proportional zur Probenkonzentration, sodass die Zahl der Partikel im Streuvolumen während des Messvorgangs konstant bleiben sollte. Wenn die Partikelgröße jedoch zunimmt, sinkt die Zahl der Partikel im Streuvolumen, bis es zu schwerwiegenden Momentanzahlenschwankungen im Streuvolumen kommt. Diese Zahlenschwankungen werden durch Änderungen der Partikelanzahl im Streuvolumen während der DLS-Messungen definiert.

Um Zahlenschwankungen zu verhindern, muss die Probenkonzentration erhöht werden. Dies erhöht jedoch den Einfluss von Mehrfachstreuung auf die erzielten Ergebnisse. Die Verwendung von Rückstreu-Erkennung zusammen mit einer variablen Messposition ermöglicht die Messung höherer Probenkonzentrationen und verhindert so Zahlenschwankungsprobleme. Zahlenschwankungen werden normalerweise durch einen ansteigenden und schwankenden Basiswert in der Korrelationsfunktion angezeigt.

Ein weiteres Problem beim Messen von großen Partikeln mit DLS ist die Sedimentation. Alle Partikel sedimentieren, und die Geschwindigkeit hängt von der Partikelgröße sowie der relativen Dichte der Partikel und des Suspensionsmediums ab. Für DLS sollte die Sedimentation langsamer als die Diffusion sein. Große Partikel diffundieren langsam, sodass Sedimentation ein bedeutenderes Problem wird.

Das Vorhandensein von Sedimentation kann durch Überprüfung der Stabilität der Zählrate in aufeinanderfolgenden Messungen derselben Probe festgestellt werden. Eine abnehmende Zählrate bei aufeinanderfolgenden Messungen deutet auf das Vorhandensein von Sedimentation hin, und Zetasizer Software wird dies dem Benutzer hervorheben.

Es kann von Vorteil sein, die Partikel in einem Medium von ähnlicher Dichte zu suspendieren, vorausgesetzt die Viskosität wird nicht signifikant erhöht. In dieser Anwendungshinweis wurden Proben von 3, 6 und 8,9 mm Latex in 13 % w/v Saccharose, die die gleiche Dichte wie das Latex hat, vorbereitet.

Die für die 3, 6 und 8,9 μm Latexproben erzielten Ergebnisse befinden sich im erwarteten Größenbereich unter Verwendung der DLS-Technik. Sie wurden bei Konzentrationen zwischen 0,15 und 0,24 % w/v gemessen. Diese Ergebnisse bestätigen, dass durch die Verwendung der Rückstreu-Erkennung Mehrfachstreuungseffekte minimiert wurden und Zahlenschwankungen und Sedimentation die erzielten Ergebnisse nicht beeinflusst haben.

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Referenzen

[1] R. Pecora (1985) Dynamische Lichtstreuung: Anwendungen der Photonenkorrelationsspektroskopie. Plenum Press, New York.

[2] Internationale Norm ISO13321 (1996) Leitfaden zur Bestimmung der Partikelgrößenverteilung – Teil 8: Photonenkorrelationsspektroskopie. ISO (Internationale Organisation für Normung).

[3] Internationale Norm ISO22412 (2008) Partikelgrößenanalyse: Dynamische Lichtstreuung (DLS). ISO (Internationale Organisation für Normung).

[4] National Institute of Standards and Technology, USA (www.nist.gov).

[5] R.S. Chau und K. Takamura (1988) J. Colloid Interfac Sci, 125, 266.