Diffusionsbarrierenmethode – die praktischen Details

Wie führt man eine Zetapotentialmessung mit der Diffusionsbarrierenmethode durch?

Die Diffusionsbarrierenmethode ist besonders für geringe Probenvolumen und Puffer mit hoher Ionenstärke geeignet. Die Methode besteht darin, einen „Plug“ der Probe vorsichtig in eine gefaltete Kapillare zu injizieren, die bereits nur den Puffer enthält. (Der Puffer muss derselbe Puffer wie bei der Proteinpräparation sein, gleiche Leitfähigkeit, gleicher pH-Wert, gleiche Zusätze, um die Probe und die Diffusionsbarriere so genau wie möglich anzugleichen). In diesem Setup steht vor allem das Zetapotential im Vordergrund, jedoch kann auch die Größe bestimmt werden.

Praktische Details werden in „The Diffusion Barrier Technique, Practical Aspects and Data interpretation“, der Webpräsentation „Protein Zetapotentialmessungen mit der neuen Diffusionsbarrierenmethode von Malvern“ sowie dem Anwendungshinweis „The Diffusion Barrier Technique for Accurate and Reproducible Protein Mobility Measurement„.  Nachfolgend finden Sie eine kurze Übersicht über die praktischen Aspekte dieser Methode.

Warum diese Diffusionsbarrierenmethode in Betracht ziehen?

Es gibt zwei Hauptgründe, warum Sie diese Methode in Betracht ziehen sollten. Beide liegen in der Beschaffenheit der Probe begründet.

1. Niedrige Probenverfügbarkeit. Wenn Sie nur eine sehr begrenzte Menge an Probe haben, ermöglicht diese Methode eine Messung, obwohl nur ein Teil der Kapillare die Probe enthält.  (Und der Rest der Kapillare enthält den Puffer).
2. Schutz der Probe vor Elektrodeninteraktionen. Unter bestimmten Bedingungen (z.B. hohe Ionenstärke, einige Phosphatsalze, schwefelhaltige Pufferkomponenten) kann eine Elektrodenverfärbung (Degradation) auftreten. Während die Verfärbung an sich nicht unbedingt schlecht ist, weist sie auf mögliche Proben-Elektroden-Interaktionen hin.

Weitere Effekte sind Joule-Erwärmung, Probenabbau (Aggregation) und Elektrodenpolarisation. Die Verwendung der Diffusionsbarrierenmethode kann helfen, diese negativen Effekte zu minimieren.

Wie wird die Probe eingeführt?

Die Probe wird vorsichtig mit einer Gelpipettenspitze in die mit Puffer gefüllte DTS1070-Kapillare injiziert. Wir haben die Costar-Pipettenspitzen (1-200µl, rund, 0,5mm dick, Sigma-Kat.:4853) getestet, und ähnliche sollten gut funktionieren.  Bei deren Verwendung drücken Sie die Gelpipettenspitze vorsichtig durch eine der Ladeöffnungen der Kapillare, bis Sie ein „natürliches“ Ende fühlen, und injizieren dann zunächst 70µl (so gehen Sie sicher, dass der Plug an der richtigen Stelle ist). Mit zunehmender Vertrautheit mit der Methode kann das Injektionsvolumen leicht auf 50µl, schließlich sogar auf 20µl reduziert werden. Sie können dies entweder mit einer Blauen-Dextran-Lösung üben oder das Zählraten-Monitoring im Software („Tools – Count Rate Meter“) verwenden, um sicherzustellen, dass das Streuvolumen innerhalb des Probenplugs ist.

Welche Einstellungen in der Software?

Sie sollten spezielle Instrumenteneinstellungen auswählen, um das Zetapotential von Proteinproben in Pufferlösungen mit relativ hoher Ionenstärke messen zu können. Im automatischen Modus der Zeta-Analysesoftware wird die angelegte Spannung reduziert. Aber für die schonendste Behandlung empfindlicher Proben können Sie die Analyse-Einstellungen manuell entsprechend der unten stehenden Tabelle aus dem Anwendungshinweis anpassen.

Um auf die Einstellungen während des manuellen oder SOP-Setups zuzugreifen, gehen Sie zu:

• Messung -> Messungsdauer -> Automatisch -> Maximale Anzahl der Durchläufe
  Lassen Sie das Minimum bei 10 und wählen Sie das Maximum gemäß der Tabelle
• Messung -> Messungen -> Verzögerung zwischen den Messungen (Sekunden)
  Wenn Messungen wiederholt werden, ist es sinnvoll, die Probe 30 Sekunden ruhen zu lassen
• Messung -> Erweitert -> Spannung -> Automatische Spannungsauswahl -> Nein
  Geben Sie die empfohlene Spannung gemäß der Tabelle ein

Früher

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• Komplexe Titrationen – variable Dosierung (Zeta und Größe)
• Tipps und Tricks zur Charakterisierung von Nanopartikeln (44 Fragen und Antworten)
• Erste Einführung auf Diffusionsbarrierenmethode

Wenn Sie Fragen haben, senden Sie mir bitte eine E-Mail an ulf.nobbmann@malvernpanalytical.com. Vielen Dank! Die Meinungen sind im Allgemeinen die des Autors. Unser Redaktionsteam könnte jedoch Teile modifiziert haben.